Production of mammalian glycoproteins for structural analysis: site-specific recombination systems in CHO cells
Structures of mammalian glycoproteins attracted increasing interest, as these proteins include important drug targets. Excellent recombinant expression systems for these proteins are stable mammalian cell lines. Their development, however, remains time-consuming. Another challenge for X-ray structure analysis is the heterogeneous and flexible nature of protein glycosylation which often hampers the formation of crystals. Mutant cell lines such as CHO Lec3.2.8.1 produce glycoproteins with truncated carbohydrate chains. These products can be deglycosylated and crystallized efficiently. To find well crystallisable protein constructs, structural projects often necessitate the production of a variety of different constructs per protein. Thus, a fast expression system is of essential interest for structural biology. This work describes the integration of Flp recombination strategies in order to optimise cell line development in CHO Lec3.2.8.1. Firstly, stable and high-producing loci in the host genome were tagged by a GFP gene flanked by Flp recombination target sites. Two rounds of preparative cell sorting enabled the isolating of top fluorescent cells. Depending on the strategy, the GFP gene of these cells was either exchanged against another gene by recombinase-mediated cassette exchange (RMCE) or excised (FLEx). Upon GFP deletion, the gene of interest was put under control of the promoter and thus expressed. A comparison of both recombination systems proved a higher flexibility and speed of RMCE. Altogether, 10 different production cell lines were established in a minimal amount of time. As an example, one of these proteins, a domain of human lysosome associated membrane protein 3, was produced in a bioreactor, purified, deglycosylated and crystallized. Its structure was solved by X-ray structure analysis.
Das Interesse an Raumstrukturen glykosylierter Proteine nimmt stetig zu, da unter diesen Proteinen viele wichtige pharmakologische Zielstrukturen sind. Ein hervorragendes System für die Produktion der Glykoproteine stellen stabile Säugerzelllinien dar. Ihre konventionelle Etablierung ist immer noch sehr zeitaufwendig. Ein weiteres Problem für die Röntgenstrukturanalyse ist die Heterogenität und Flexibilität von Glykosylierungen, die häufig die Bildung von Kristallen verhindern. Mutierte Zelllinien wie CHO Lec3.2.8.1 produzieren Glykoproteine mit verkürzten Zuckerseitenketten. Diese Produkte können deglykosyliert und effizient kristallisiert werden. Um zu gut kristallisierbaren Proteinkonstrukten zu gelangen, müssen oft unterschiedliche Varianten von einem Protein hergestellt werden. Daher ist ein schnelles Expressionssystem gerade für die Strukturbiologie von großem Interesse. Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Integration von Flp-Rekombinationsstrategien zur Optimierung der rekombinanten Zelllinienentwicklung in CHO Lec3.2.8.1 Zellen. Hierfür wurden genetisch stabile Loci mit starker Genaktivität im Wirtszellgenom mit einem GFP Gen und Flp-Erkennungssequenzen markiert. Zwei Zellsortierungsschritte ermöglichten die Isolierung der am stärksten fluoreszierenden Zellen. Je nach Strategie wurde das GFP entweder über Rekombinase-vermittelten Kassettenaustausch (RMCE) gegen ein anderes Gen ausgetauscht oder es wurde ausgeschnitten (FLEx). Nach der GFP Deletion wurde das zu exprimierende Gen unter die Kontrolle des Promoters gebracht und damit exprimiert. Ein Vergleich der Rekombinationssysteme zeigte die höhere Flexibilität und Schnelligkeit des RMCE Systems. Insgesamt wurden in kurzer Zeit 10 unterschiedliche Produktionszelllinien generiert. Eines der Zielproteine, eine Domäne des humanen lysosomal-assoziierten Membranprotein 3, wurde im Bioreaktor produziert, gereinigt, deglykosyliert und kristallisiert. Seine Struktur wurde mittels Röntgenstrukturanalyse aufgeklärt.
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