Synthetic Expression Systems for Controlled Perturbation of Mammalian Cellular Regulatory Networks

Sievers, Stephanie

doi:10.24355/dbbs.084-201108101018-0

Published

Synthetic Expression Systems for Controlled Perturbation of Mammalian Cellular Regulatory Networks

English
German

One focus of synthetic biology is the redesign of cellular networks to obtain insight into complex biological relations. Since lately, synthetic approaches are used to interfere with mammalian networks. In this work, perturbation of the virus-induced interferon- (IFN-) beta induction pathway was performed by stable integration of synthetic expression cassettes in IFN-beta reporter cells. The interference was realized by exploiting viral IFN antagonists such as influenza A virus NS1 and hepatitis C virus NS3/4A which were expressed from a tetracycline-dependent promoter. These cells showed time- and dose-controlled regulation of the perturbators on the single cell level. The perturbators interfered strongly with the IFN-beta induction. On the single cell level, the virus-induced IFN-beta expression course inversely correlated with the ectopically induced expression of the viral perturbators. The latter was clearly associated with an arrest of IFN-beta signal increase. Moreover, monitoring the time course of perturbator expression and arrest of reporter expression indicated that even an ongoing IFN-beta induction can be interrupted by expression of the perturbators. This finding was confirmed by monitoring intracellular localization of IRF-7 which relocates from the nucleus upon perturbator induction. Besides this finding, the results underline the benefit of synthetic expression modules to specifically perturb individual steps within complex regulatory cascades in a highly controlled way – a prerequisite to establish mathematical models towards systems biology based understanding.

Ein Ziel der Synthetischen Biologie ist die Neukonstruktion von regulatorischen Netzwerken, um Einblicke in komplexe, biologische Zusammenhänge zu erhalten. Seit Kurzem werden synthetische Expressionsmodule benutzt, um mit zellulären Netzwerken zu interferieren. In dieser Arbeit wurde eine Perturbation der Virus-induzierten Interferon- (IFN-) beta Induktion unter Nutzung synthetischer Expressionskassetten durchgeführt. Die Perturbation wurde durch virale IFN-Antagonisten (Influenza A Virus NS1 und Hepatitis C Virus NS3/4A) erreicht, welche stabil in IFN-beta Reporterzellen integriert und durch einen tetrazyklinabhängigen Promoter kontrolliert exprimiert wurden. Diese Zellen zeigten zeit- und dosisabhängige Regulation der Perturbatoren auf Einzelzell-Ebene. Die Expression der viralen Perturbatoren interferierte mit der virus-induzierten IFN-beta Reporterexpression. Auf Einzelzell-Ebene zeigte der Verlauf der Virus-induzierten IFN-beta Expression eine inverse Korrelation zur ektopisch induzierten Expression der viralen Perturbatoren. Letztere war mit einem Arrest der IFN-beta Zunahme assoziiert. Mit Hilfe dieses Zellsystems konnte erstmals die Konsequenz der Perturbatorexpression auf die IFN-beta Induktion zeitlich aufgelöst werden. Die Ergebnisse legten nahe, dass eine bereits in Gang gesetzte IFN-beta Induktion durch Expression der Perturbatoren unterbrochen werden kann. Dies wurde durch die Untersuchung der intrazellulären Lokalisation von IRF-7, welches nach Induktion des Perturbators aus dem Zellkern exportiert wird, bestätigt. Neben der Aufdeckung dieses bisher nicht bekannten Mechanismus unterstreichen diese Ergebnisse den Nutzen von synthetischen Expressions-Modulen für die strikt kontrollierte Perturbation von zellulären regulatorischen Kaskaden - eine Voraussetzung, um mathematische Modelle zu generieren.