Entwicklung eines Verfahrens zur kontinuierlichen, gerichteten Evolution hochaffiner Protein-Liganden in vitro

Meysing, Maren

doi:10.24355/dbbs.084-201106061020-0

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Entwicklung eines Verfahrens zur kontinuierlichen, gerichteten Evolution hochaffiner Protein-Liganden in vitro

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Die gerichtete Evolution ermöglicht die Modifikation von Proteinen und Nukleinsäuren nach den drei Prinzipien von Darwin - Mutation, Selektion und Replikation. Bisherige Methoden sind durch ihre diskontinuierliche Form und ihre Variantenanzahl limitiert. Ziel dieser Arbeit war die Etablierung eines Verfahrens zur kontinuierlichen, gerichteten Evolution hochaffiner Protein-Liganden in vitro. Dabei wurde erstmals die Kombination einer fehlerbehafteten DNA-Amplifikation (NASBA) mit einem in vitro Proteinsynthesesystem gezeigt. Verschiedene Parameter der NASBA wurden hinsichtlich einer effizienteren Amplifikation von DNA-Templates optimiert. Mutationen, basierend auf der fehlerbehafteten Aktivität von T7 RNA Polymerase und MMuLV RT, wurden analysiert und die Mutationsraten mit Hilfe des seriellen Transfer-Prinzips gesteigert. Für den Selektionsschritt, basierend auf der Affinität zweier Interaktionspartner, wurde die Expression und Aufreinigung von T7 RNA Polymerase-Fusionsproteinen optimiert. Die Fusion der zu evolvierenden Bindepartner an die MMuLV RT zeigte einen vernachlässigbaren Effekt auf die Reverse Transkriptase-Aktivität. Für die Kombination von NASBA und in vitro Proteinexpression wurde das PURE System, das im Gegensatz zu E.coli Lysaten die DNA-Amplifikation nicht inhibierte, verwendet. Nach Optimierung der Nukleotid- und Magnesiumionenkonzentration konnte erstmals eine funktionelle Kombination von NASBA und in vitro Proteinsynthese in einem Reaktionsansatz stattfinden. Weiterhin wurde gezeigt, dass das NASBA-Produkt als Template für die Proteinexpression fungieren kann und eine endogen exprimierte MMuLV RT ausreichend Aktivität besitzt, um die NASBA anzutreiben. Versuche mit einem Test-Interaktionspaar ergaben, dass der Selektionsschritt innerhalb des Systems weiterer Optimierung bedarf. Damit wurden grundlegende Voraussetzungen für ein System zur kontinuierlichen, gerichteten Evolution hochaffiner Protein-Liganden geschaffen.

Directed evolution based on the three principles of mutation, selection and replication has become a popular strategy to modify proteins and nucleic acids. But today’s methods for directed evolution are still limited in their variant diversity and discontinuous in their nature. Aim of this work was to establish an in vitro system for continuous directed evolution of high affinity protein ligands. Thereby, an erroneous DNA amplification method was combined with an in vitro protein synthesis system for the first time. NASBA, an isothermal method to amplify short RNA molecules, was optimised regarding incubation temperature, buffer conditions, enzymes and primers to achieve efficient amplification of DNA templates. Mutations due to the error-prone activities of T7 RNA polymerase and MMuLV RT were analysed and mutation rates could be increased by applying the serial transfer principle. Selection should rely on the affinity of two interacting partners. Expression and purification parameters of T7 RNA polymerase fusion proteins were optimized. The fusion of MMuLV RT to binding partners only hardly affected reverse transcriptase activity. To combine NASBA and in vitro protein expression the PURE System was chosen, which in contrary to E. coli lysates caused no inhibition of DNA amplification during NASBA. The concentrations of nucleotides and magnesium ions turned out to be highly critical and were readjusted to facilitate a functional combination of NASBA and in vitro protein synthesis within one reaction. It was shown that NASBA products can function as templates for protein expression and that endogenously expressed MMuLV RT exhibits enough activity to drive NASBA amplification. First trials with an interacting couple revealed that both - NASBA and in vitro protein synthesis - operate simultaneously, but the selection step needs to be further optimised. In summary, fundamental preconditions for a continuous directed evolution system were established within this work.