Erzeugung von Amylosucrase-Enzymvarianten mit neuen katalytischen Eigenschaften unter Verwendung von neu konstruierten Produktionsstämmen

Amylosucrase (AS) aus Neisseria polysaccharea katalysiert den Transfer von Glucose-Resten aus Saccharose (Sac) auf eine wachsende Glucosekette. Für dieses Enzym wurden zwei effiziente E.-coli-Expressionssysteme entwickelt. Über einen His-tag konnte die AS einfach gereinigt werden. Das Enzym war in der Lage, auch das Sac-Analogon Allosaccharose langsam zu hydrolysieren und den Allosylrest auf Arbutin als Akzeptor zu übertragen. Es wurden gezielt AS-Varianten erzeugt, in denen die Aminosäure (AA) Tyr147 gegen AA mit verschiedenen Typen von Seitenketten ausgetauscht war. Die z. T. drastische Verringerung der katalytischen Aktivität zeigte die wichtige Rolle dieser AA. Ein Umsatz der Sac-Analoga Allo-, Galacto-, Manno- oder Xylosaccharose wurde nicht festgestellt. Verschiedene Banken von AS-Varianten wurden durch statistische Mutagenesen in fünf Segmenten hergestellt, welche für je vier bis sechs im Aktiven Zentrum oder in dessen unmittelbarer Umgebung liegende AA codieren. Ein Screening von ca. 45.000 dieser Klone auf Allosaccharose-Umsatz ergab lediglich falsch-positive Treffer. In einem zweiten Screening wurden die Varianten-Banken auf Defizienz in der Polymerbildung untersucht. Dabei wurden in einer der Banken Varianten gefunden, die nicht mehr in der Lage waren, Produkte mit mehr als drei Glucose-Einheiten zu bilden. Die Ermittlung der ausgetauschten AA deutete darauf hin, dass hauptsächlich Substitutionen in den Positionen 394 und 396 zur Limitierung der Elongationsfähigkeit beitragen. Die strukturelle Modellierung von fünf Varianten spricht dafür, dass die veränderten Eigenschaften hauptsächlich das Ergebnis sterischer Interferenzen in den subsites +1 bis +3 zwischen der wachsenden Glucosekette und AA-Seitenketten an diesen beiden Positionen sind.