Untersuchungen zur selektiven Promotoraktivierung im komplex regulierten Lokus der myogenen Faktoren Mrf4 und Myf5
Die Entwicklung der Skelettmuskulatur in Vertebraten wird durch vier bHLH Transkriptionsfaktoren, den myogenen Regulationsfaktoren (MRFs), kontrolliert. Zwei dieser MRFs, Myf5 und Mrf4, sind auf Chromosom 10 in einem Abstand von 8 kb in derselben transkriptionellen Orientierung lokalisiert. Die komplexen Expressionsmuster dieser Gene werden durch verschiedene Enhancer, die über einen Bereich von 140 kb verteilt sind, reguliert, weshalb die Frage gestellt werden muss, wie solche Elemente die Koordination und Selektivität für die spezifische Aktivierung der Zielgene realisieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Mechanismen, die der selektiven Promotoraktivierung durch den distalen –58/-56 kb Enhancer, welcher Myf5 u.a. in den Muskelvorläuferzellen der Extremitäten aktiviert, und den Early Epaxial Enhancer (EEE), der für frühe Myf5 Expression im epaxialen Myotom zuständig ist, untersucht. Durch die Herstellung transgener Reportergenkonstrukte konnten für beide untersuchte Enhancer Bereiche stromaufwärts des Mrf4-Promotors kartiert werden, welche für das selektive Verhalten der Enhancer verantwortlich sind. Es wurde für beide Enhancer gezeigt, dass die Regulation unabhängig vom responsiven Myf5-Promotor erfolgt und durch blockierende Mechanismen am Mrf4-Promotor realisiert wird. Es ist zudem wenig darüber bekannt, auf welche Weise distale Elemente wie der -58/-56 kb Enhancer die Regulation der Zielpromotoren realisieren. Direkte Interaktion zwischen distalem Enhancer und Myf5-Promotor konnte durch Anwendung des Chromosme Conformation Capturings in Muskelvorläuferzellen der Somiten und Extremitäten nachgewiesen werden, was zu einer Veränderung der chromosomalen Struktur und der Bildung von Chromatin-Schlaufen führt. Solche Strukturen wurden spezifisch für Myf5-exprimierende Zellen nachgewiesen. Es erfolgen keine Co-Lokalisationen zwischen dem Enhancer und dem Mrf4-Promotor, wodurch die Selektivität des Enhancers auf molekularer Ebene belegt werden konnte.
The development of skeletal muscle in vertebrates is controlled by four bHLH transcription factors, the myogenic regulatory factors (MRFs). Two of these MRFs, Myf5 and Mrf4, are located on chromosome 10 in a distance of 8 kb in the same transcriptional orientation. The complex expression patterns of these genes are regulated by different enhancers, which are distributed over a range of 140 kb, raises the question how such elements realize the coordination and selectivity for the specific activation of the target genes. In this study the mechanisms of selective promoter activation by the -58/-56 kb distal enhancer, which controls the activation of Myf5 in the muscle precursor cells of the limbs, and the early epaxial enhancer (EEE), which is responsible for Myf5 expression in the early epaxial myotome, are examined. Transgenic reporter constructs showed for both enhancers sequences upstream of the Mrf4-promoter that are responsible for the selective behavior of the enhancers. It has been shown for both enhancer, that the regulation is independently of the responsive Myf5-promoter and implemented by blocking mechanisms on the Mrf4-promoter. There is also little known about how the -58/-56 kb distal enhancer element realizes the regulation of target promoter over such a long distance. Direct interaction between the distal enhancer and Myf5-promoter could be detected in muscle precursor cells of the somites and limbs by using the Chromosme conformation capture, which leads to a change in chromosomal structure and the formation of chromatin loops. Such structures were specifically detected for Myf5-expressing cells. There was no co-localization of the enhancer and the Mrf4-promoter.
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