Isolation and characterization of suppressors of the prp1 gene, encoding a regulatory component of the pre-catalytic spliceosome in fission yeast

Razanau, Aleh

doi:10.24355/dbbs.084-201012131136-0

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Isolation and characterization of suppressors of the prp1 gene, encoding a regulatory component of the pre-catalytic spliceosome in fission yeast

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German

Prp1 (U5-102K/Prp6) is a highly conserved spliceosomal protein necessary for the structural integrity of pre-catalytic spliceosomes. The protein consists of multiple HAT (half a TPR) repeats preceded by an N-terminal domain showing no similarity with known motifs. We show here that mutations within the N-terminus lead to the accumulation of pre-catalytic spliceosomal particles which consist of snRNPs U1, U2, U5, U4/U6 and contain unspliced pre-mRNA. These results demonstrate that structural integrity of the N-terminus is required to mediate a splicing event, but is not necessary for the assembly of spliceosomes. The temperature sensitive allele prp1-127ts containing a point mutation in HAT8 was used to isolate six extragenic suppressors. Two extragenic suppressors, spp101-1 and spp102-1, were further analysed: spp102 encodes Spp42/Prp8 (U5-220K), a protein which has been shown to act as a central organizer during activation of a spliceosome; spp101 encodes Lin1 (U5-52K). Lin1 is not stably associated with Prp1 suggesting transient interaction between these proteins. In a strain expressing prp1-127ts the steady state level of the mutant Prp1G705D protein is visibly lower when compared with Prp1wt in a wild-type strain at 35 ºC. The expression of the mutant Lin1D167N protein in the suppressor strain (spp101-1/lin1-1 prp1-127ts) does not lead to the stabilization of Prp1G705D at 35 °C suggesting that the mechanism of suppression is not due to the stabilization of Prp1 by Lin1. The mutant Prp1G705D still able to associate with pre-catalytic spliceosomes prevents their activation at the restrictive temperature. Expression of the suppressor gene spp101-1/lin1-1, however, allows activation of those pre-catalytic spliceosomes associated with Prp1G705D. Therefore, it is conceivable that Lin1D167N improves the interactions of other spliceosomal proteins with Prp1G705D thus operating as a chaperone.

Prp1 (U5-102K/Prp6) ist ein hochkonserviertes spleißosomales Protein welches für die strukturelle Integrität des prä-katalytischen Spleißosoms essentiell ist. Das Protein besteht aus multiplen Wiederholungen eines HAT Sequenzmotivs, denen eine N-terminale Domäne vorangeht, die keine Ähnlichkeit mit bekannten Sequenzmotiven aufweist. Mutationen in der N-terminalen Domäne führen zur Akkumulation von prä-katalytischen spleißosomalen Partikeln, die aus den snRNPs U1, U2, U5 und U4/U6, sowie ungespleißter prä-mRNA zusammengesetzt sind. Dieses Ergebnis zeigt, daß die strukturelle Integrität der N-terminalen Domäne erforderlich ist um ein Speißereignis zu vermitteln, aber nicht für den Zusammenbau des Spleißosoms erforderlich ist. Das temperatur-sensitive Allel prp1-127ts, das eine Punktmutation im achten HAT-Motiv enthält, wurde dazu verwendet sechs extragene Suppressoren zu isolieren. Davon wurden zwei, spp101-1 und spp102-1 näher untersucht: spp102-1 kodiert für Spp42/Prp8 (U5-220K), einem Protein, das bei der Aktivierung des Spleißosoms von besonderer Bedeutung ist; spp101-1 kodiert für Lin1 (U5-52K). Lin1 ist nicht stabil an Prp1 gebunden, was auf eine transiente Interaktion zwischen beiden Proteinen hinweist. In einem Stamm der das prp1-127ts Allel exprimiert ist die Konzentration des mutierten Prp1G705D Proteins viel geringer als die Konzentration von Prp1wt in einem wildtyp Stamm, der bei 35 °C gewachsen ist. Die Expression des mutierten Lin1D167N Proteins im Suppressor Stamm (spp101-1/lin1-1 prp1-127ts) führt nicht zur Stabilisierung von Prp1G705D, was darauf hinweist, daß die Suppression nicht über eine von Lin1 vermittelte Stabilisierung von Prp1G705D erfolgt. Das mutierte Prp1G705D Protein kann noch immer mit dem prä-katalytischen Spleißosom assoziieren und so seine Aktivierung bei der restriktiven Temperatur verhindern. Dennoch ermöglicht die Expression des Suppressorgens spp101-1/lin1-1 die Aktivierung des mit Prp1G705D assoziierten prä-katalytischen Spleißosoms. Daher erscheint es möglich, daß Lin1D167N die Interaktion zwischen Prp1G705D und anderen spleißosomalen Proteinen fördert, d.h. als Chaperon funktioniert.