Genetic tools for high yield protein production with Bacillus megaterium
The Bacillus megaterium protein production system based on the xylose-inducible promoter (PxylA) was systematically optimized. Multiple changes in basic promoter elements such as the 10 and -35 region and the ribosome-binding site resulted in an 18-fold increase of protein production. This new high performance (hp)-system enabled the production of 82.5 mg / gCDW of the model protein Gfp. Furthermore, signal peptides for Sec-dependent protein secretion were predicted in silico using the B. megaterium genome sequence. Subsequently, the leader peptides of Vpr, NprM, YngK, YocH and a computationally designed peptide were experimentally validated. Highest yields were obtained using B. megaterium carrying a hp-expression plasmid encoding SPYocH for export of Tfh (7,200 U / L or 7.7 mg / L). Nevertheless, observed principle limitations in protein export might be related to components of the Sec-dependent protein transport system. The predicted RNA polymerase (RNAP) of Escherichia coli phage K1E was produced recombinantly, purified to apparent homogeneity and employed for in vitro RNA synthesis. Optimal assay conditions (pH 8, 37 °C, 10 mM MgCl2 and 1.3 mM spermidine) were established. The corresponding promoter regions were identified on the phage genome and summarized in a sequence logo. Surprisingly, next to K1E promoters also the consensus SP6 promoter was recognized efficiently in vitro by K1E RNAP. Based on these results, a system for high yield in vitro RNA synthesis (5 µg purified RNA per µg template DNA) using K1E RNAP was established. Finally, in vivo protein production systems for B. megaterium were established on K1E phage RNAP transcription. Up to 61.4 mg / gCDW of the reporter protein Gfp were produced and up to 3,000 U / L (equals 3.2 mg / L) of extracellular Tfh were formed. This thesis established novel, now commercially available high yield protein production and export systems for B. megaterium.
Das auf dem Xylose-induzierbaren Promotor (PxylA) basierte Bacillus megaterium Proteinproduktionssystem wurde einer systematischen Optimierung unterzogen. Die Kombination genetischer Modifikationen resultierte in einer bis zu 18-fachen Erhöhung der Proteinproduktion. Dieses neu entwickelte Hochleistungssystem (hp System) ermöglichte die Produktion von bis zu 82,5 mg / gCDW des Modelproteins Gfp. Des Weiteren wurden mit Hilfe der Genomsequenz von B. megaterium Signalpeptide zur Sec-abhängigen Proteinsekretion vorhergesagt. Die Signalpeptide von Vpr, NprM, YngK und YocH wurden experimentell untersucht. Die größten Mengen sekretierteren Modelproteins (Tfh) wurden mit dem hp-Expressionssystem in Kombination mit dem Signalpeptid von YocH erreicht (7.200 U / L oder 7,7 mg / L). Trotzdem wurden auch grundsätzliche Limitierungen im Sec-abhängigen Proteintransport festgestellt. Die im Genom des Escherichia coli Phagen K1E annotierte RNA Polymerase (RNAP) wurde rekombinant produziert, gereinigt und schließlich für die in vitro RNA Synthese eingesetzt. Dafür wurden die optimalen Reaktionsbedingungen bestimmt (pH 8, 37 °C, 10 mM MgCl2, 1,3 mM Spermidin). Mittels bioinformatischer Analyse wurden mögliche Promotoren im Genom des Phagen identifiziert und ein Promotorsequenzlogo erstellt. Neben dem K1E Konsensuspromotor wurde in vitro auch der Promotor des SP6 Bakteriophagen effizient von der K1E RNAP erkannt. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde ein produktives in vitro RNA Synthesesystem konstruiert (5 µg gereinigte RNA pro µg Matrizenplasmid). Schließlich wurden in vivo Proteinproduktionssysteme für B. megaterium basierend auf der Transkription durch die K1E RNAP erstellt. Hiermit wurden intrazelluär bis zu 61,4 mg / gCDW an Gfp und extrazellulär bis zu 3.000 U / L (entsprechend 3,2 mg / L) Tfh produziert. Im Rahmen dieser Arbeit wurden neue, hocheffiziente und bald kommerziell erwerbliche Systeme zur intra- und extrazellulären Proteinproduktion mit B. megaterium entwickelt.
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