Chip-basierte Systeme zum Nachweis von RNA- und DNA-Viren

Im Rahmen der vorliegenden Doktorarbeit wurden immunologische und molekularbiologische Biochip-Nachweise für Viren, welche als potentielle biologische Waffen angesehen werden, aufgebaut, getestet und optimiert. Die Besonderheit des benutzten Microarray-Systems besteht in der Tatsache, dass die gesamte Nachweis-Reaktion in einer Kartusche mit integriertem Biochip unterbrechungsfrei abläuft und dass die Kartusche – je nach immobilisiertem Fängerset – sowohl für die immunologische als auch molekularbiologische Identifikation von Viren genutzt werden kann. Der immunologische Nachweis auf Basis eines klassischen Sandwich-ELISAs von Alpha- und Orthopockenviren gelang innerhalb von 30 Minuten mit Nachweisgrenzen pro Kartusche von 500 bzw. 200000 infektiösen Einheiten für VacV bzw. VEEV. Der Zeitbedarf für diese molekularbiologische Identifikation der Alpha-, Flavi- und Orthopockenviren betrug anderthalb bis zwei Stunden. Die Titrationen der einzelnen Viren ergaben abhängig vom nachzuweisenden Genabschnitt Nachweisgrenzen im Bereich zwischen 10 und 100 Genomkopien pro Ansatz. Anders als in anderen Biochip-Systemen erfolgt der molekularbiologische Nachweis in dem hier vorgestellten System als direkte Kombination von Nukleinsäureamplifikation und Hybridisierung an die spezifischen Fängersonden. Für diesen unterbrechungsfreien Reaktionsablauf wurde einerseits die Enzym-, Magnesiumchlorid- und Primerkonzentration im Reaktionsmix und andererseits die Temperatur- und Zeitparameter der Prozessierungsbedingungen optimiert. Zusätzlich erfolgte die Weiterentwicklung und Verbesserung der Oligonukleotidsonden für eine sensitive und spezifische Identifizierung verschiedener Virusstämme einer Virusgattung. Für alle untersuchten Alpha-, Flavi- und Orthopockenviren konnten spezifische, signalintensive Nachweise für das Biochip-Format etabliert werden. Ein Parallelnachweis von bis zu drei verschiedenen Viren ist zeitgleich auf dem Biochip mit ausreichenden Sensitivitäten möglich.