Environmental factors influence virulence of Pseudomonas aeruginosa
Research into the importance of phosphate as an environmental signal molecule for multicellular behavior in the Pseudomonads P. aureofaciens and P. fluorescens recently uncovered a role of the Pho regulon in the formation of bacterial biofilms. Most interestingly, it was clearly demonstrated that PhoB activates a phosphodiesterase which decreases the intracellular c-di-GMP levels in P. fluorescens, thus providing a link between the Pho regulon and c-di-GMP signaling pathways that impact on biofilm formation. In this study we present evidence that in the opportunistic pathogen P. aeruginosa the Pho regulon inhibits biofilm formation and is required for the repression of the TTSS. We furthermore identified an EAL domain protein, referred to as RapA, as a down-stream effector of the Pho regulon, which at least partially mediated the observed inhibition. Although the Pho regulon contributed to inhibition of biofilm formation, it had no effect on CupA fimbriae expression or Psl exopolysaccharide expression, the common factors contribute to biofilm formation in P. aeruginosa. Interestingly, in contrast to P. aeruginosa PAO1 strain, the observed inhibition of the biofilm formation was Pho regulon-dependent but independent of the availability of inorganic phosphate in PA14 strain. The Pho regulon-dependent repression of TTSS was also independent of the availability of inorganic phosphate in PA14 strain. These results add even more complexity to the regulation of the bacterial behavior by environmental cues. We demonstrated that a wild-type derived flgF mutant exihibited an enhanced biofilm formation as compared to the wild-type as shown by CSLM. Moreover, ExoT expression was strongly enhanced in the flgF mutant as compared to the wild-type indicating that the FlgF, similar to Pho regulon, negatively influences virulence phenotype (inhibition of biofilm formation and repression of the type three secretion system). We found that Pho regulon has no influence on the FlgF or flagella. Although the transcriptome analysis of the flgF mutant compared to the wild-type did not uncover an influence of FlgF on Pho regulon, it confirmed that the TTSS is negative regulated by the FlgF because most of genes encoding for TTSS were up-regulated. Moreover, pyochelin encoding genes were strongly down-regulated. We illustrated that both of the Pho regulon and the FlgF affect the production of siderophores. The pyochelin production was enhanced by PhoB and FlgF. The pyoverdine production was enhanced by PhoB but inhibited by FlgF. We also found that both of the Pho regulon and the FlgF are regulating the same virulence phenotype but independently. Our results add more complexity to the regulation of biofilm formation and TTSS expression in P. aeruginosa.
Untersuchungen über die Bedeutung von Phosphat als umweltbedingtes Signalmolekül für ein multizelluläres Verhalten der Pseudomonaden P. aureofaciens und P. fluorescens haben kürzlich die Rolle des Pho Regulons in der Ausbildung von Biofilmen enthüllt. Interessanterweise wurde eindeutig gezeigt, dass PhoB eine Phosphodiesterase aktiviert, die den intrazellulären c-di-GMP Spiegel in P. fluorescens absenkt. Hierdurch wird eine Verknüpfung zwischen dem Pho Regulon und c-di-GMP Signalwegen, welche ebenfalls einen Einfluss auf die Biofilmbildung haben, erstellt. In dieser Arbeit wurde nachgewiesen, dass das Pho Regulon auch in dem opportunistischen Krankheitserreger P. aeruginosa die Biofilmbildung inhibiert und für die Unterdrückung des Typ-Drei-Sekretionssystemes benötigt wird. Weiterhin wurde als ein Downstream Effektor des Pho Regulons ein EAL-Domänen Protein identifiziert, welches RapA genannt wurde und zumindest teilweise die beobachtete Inhibierung vermittelte. Obwohl das Pho Regulon zu einer Inhibierung der Biofilmbildung beitrug, hatte es keinen Effekt auf die Expression von CupA Fimbrien oder Psl Polysacchariden - allgemeinen Faktoren die zur Ausbildung von Biofilmen in P. aeruginosa beitragen. Im Gegensatz zu dem Stamm PAO1 war die beobachtete Hemmung der Biofilmbildung in dem Stamm PA14 zwar abhängig von dem Pho Regulon, aber unabhängig von Vorkommen an anorganischem Phosphat. Die Pho abhängige Unterdrückung des Typ-Drei-Sekretionssystems in PA14 war ebenfalls unabhängig von Vorkommen an anorganischen Phosphat. Diese Ergebnisse unterstreichen die Komplexität der Regulation bakteriellen Verhaltens durch Einflüsse aus der Umwelt. Weiterhin konnten wir durch CLSM zeigen, das eine vom Wildtyp abstammende flgF Mutante eine erhöhte Biofilmbildung im Vergleich zum Wildtyp aufweist. Außerdem war die ExoT Expression in der flgF Mutante im Vergleich zum Wildtyp stark erhöht. Das deutet darauf hin, dass FlgF, ähnlich wie das Pho-Regulon, den Virulenz-Phänotyp negativ beeinflusst (Inhibierung der Biofilmbildung und Unterdrückung des Typ-Drei-Sekretionssystems). Nachforschungen haben ergeben, dass das Pho Regulon keinen Einfluss auf FlgF oder Flagellen besitzt. Eine Transkriptionsanalyse der flgF Mutante im Vergleich zum Wildtyp ließ ebenfalls keinen Einfluss von FlgF auf das Pho-Regulon erkennen. Es wurde jedoch die negative Regulation des Typ-Drei-Sekretionssystemes durch FlgF bestätigt, da die meisten Gene, die für das Typ-Drei-Sekretionssystem kodieren, in der flgF Mutante hochreguliert waren. Zusätzlich waren Pyochelin kodierende Gene stark herunterreguliert. Schließlich konnten wir zeigen, dass beides, das Pho Regulon und FlgF, die Produktion von Siderophoren beeinflusst. Während die Pyochelinsynthese durch PhoB und FlgF erhöht wurde, wurde die Produktion von Pyoverdin durch PhoB erhöht, durch FlgF jedoch gehemmt. Wir konnten ebenfalls demonstrieren, dass das Pho Regulon und FlgF den selben Virulenz- Phänotyp regulieren, jedoch unabhängig voneinander.
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