Biphenyl Synthase from Gentian and Pear

Institut für Pharmazeutische Biologie
Swiddan, Asya Khemaj

Gentiana lutea (Gentianaceae) is a herbaceous medicinal plant containing amarogentin, while pears (Pyrus sp., Rosaceae) are important fruit trees and cultivated in all temperate-zone countries. Despite their high economic value, their disease resistance mechanisms are poorly understood. Following fungal infection, biphenyls and dibenzofurans are formed as phytoalexins. Biphenylcarboxylate synthase (BICS) from gentian and biphenyl synthase (BIS) from pear are related plant-specific PKSs that are the key enzymes of the biosynthetic pathways of amarogentin and Maloideae-specific phytoalexins, respectively. Two cDNA fragments were obtained from G. lutea. The clones were 1343 and 741 bp long and shared 60.8, 51.8 % identity, respectively with chalcone synthase (Ms, CHS) but lacked appreciable identity with BIS and benzophenone synthase (BPS). In addition, two BIS cDNAs cloned from young leaves of P. communis were functionally characterized. Both enzymes preferred benzoyl-CoA (Km 1.6 for BIS1 and 1.7 for BIS2). With salicoyl-CoA, the enzymatic product was 4-hydroxycoumarin. The two recombinant proteins cannot accept both m- and p-hydroxybenzoyl-CoAs and p-coumaroyl-CoA. Expression of the BISs was studied in leaves of P. communis after infection with Erwinia amylovora. While BIS2 was constitutively expressed, BIS1 was induced after infection. Six residues differ between the BIS1 and BIS2 amino acid sequences and were altered in BIS1 by site-directed mutagenesis. The S275N mutation enhanced the catalytic activity with both benzoyl-CoA and salicoyl-CoA as starters, while the L299F substitution abolished the activity with salicoyl-CoA. The double mutant S275N/L299F exhibited strongly increased activity with both starter substrates.

Gentiana lutea (Gentianaceae) ist eine krautige Heilpflanze und enthält Amarogentin, während Birnen (Pyrus sp., Rosaceae) wichtige Obstbäume sind und in allen Ländern gemäßigter Zonen kultiviert werden. Trotz ihres hohen wirtschaftlichen Wertes sind ihre Resistenzmechanismen gegenüber Krankheiten wenig erforscht. Nach Pilzinfektion werden Biphenyle und Dibenzofurane als Phytoalexine gebildet. Die Biphenylcarboxylat-Synthase (BIC) aus Enzian und die Biphenyl-Synthase (BIS) aus Birnen sind verwandte pflanzenspezifische PKS und stellen die Schlüsselenzyme der Biosynthese von Amarogentin und Maloideae-spezifischer Phytoalexine dar. Zwei cDNA-Fragmente von G. lutea wurden erhalten. Die Klone hatten eine Länge von 1343 und 741bp und wiesen eine Identität von 60,8 bzw. 51,8% mit Chalcon-Synthase (Ms, CHS) auf, aber keine nennenswerte Identität mit BIS und Benzophenon-Synthase (BPS). Darüber hinaus wurden die cDNAs zweier BIS aus jungen Blättern von P. communis kloniert und funktionell charakterisiert. Beide Enzyme bevorzugten Benzoyl-CoA (Km 1.6 für BIS1 und 1.7 für BIS2). Mit Salicoyl-CoA war das enzymatische Produkt 4-Hydroxycoumarin. Die beiden rekombinanten Proteinen konnten sowohl m-und p-hydroxybenzoyl-CoA, als auch p-Coumaroyl-CoA nicht akzeptieren. Die Expression der BISs wurde in Blättern von P. communis nach Infektion mit Erwinia amylovora untersucht. Während BIS2 konstitutiv exprimiert wurde, fand eine BIS1-Induktion nur nach Infektion statt. Sechs Reste unterscheiden zwischen der BIS1-und BIS2-Aminosäuresequenz und diese wurden in BIS1 durch ortsspezifische Mutagenese verändert. Die Mutation S275N verstärkte die katalytische Aktivität sowohl mit Benzoyl-CoA, als auch mit Salicoyl-CoA als Starter, während die Substitution L299F die Aktivität mit Salicoyl-CoA aufhob. Die Doppel-Mutante S275N/L299F zeigte eine stark erhöhte Aktivität mit beiden Starter-Substraten.



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