Die Regulation der Acetoinbiosynthese in Bacillus subtilis durch den transkriptionellen Regulator AlsR
Das alsSD Operon, dessen Produkte für die Enzyme der Acetoinbiosynthese kodieren, wird in B. subtilis vom Regulator AlsR reguliert. In dieser Arbeit wurde AlsR aus B. subtilis heterolog in E. coli produziert und durch Affinitäts-Chromatographie gereinigt. Nach Reinigung und Abspaltung des Affinitäts- und Löslichkeits-Tags wurde eine spezifische Bindung von AlsR an ein alsSD Promotorfragment durch Gelretardationsanalysen gezeigt. Mittels DNaseI-Protektionsanalysen wurde die Region bestimmt, an die AlsR innerhalb des alsSD Promotors bindet. Nach ortsgerichteter Mutagenese und anschließender alsS-lacZ Expressionsanalyse mutierter Promotorfragmente wurde die AlsR-Box mit der Sequenz TAAT-N11-ATTA an Position -67 des alsSD Promotors definiert. Für AlsR wurde u.a. Acetat als Effektor postuliert (Renna et al. 1993). Der interne pH-Wert, Acetat und Lactat wurden u.a. als potentielle Effektoren von AlsR untersucht. Der intrazelluläre pH-Wert von B. subtilis Zellen betrug unter fermentativen Wachstumsbedingungen 7,5 und unter anaeroben Wachstumsbedingungen mit Nitrat 7,4. Daher wurde der pHi als Effektor von AlsR ausgeschlossen. Gelretardationsanalysen in Anwesenheit potentieller Effektoren führten zu keiner veränderten DNA-Bindungsfähigkeit von AlsR. Auch in vitro Transkriptionsanalysen in Anwesenheit potentieller Effektoren führten zu keiner Änderung der alsS Transkriptmenge. Neben dem postulierten Effektor Acetat kommt auch Lactat als Effektor von AlsR in Frage. Der Transkriptionsstartpunkt von alsR wurde durch "Primer Extension"-Analysen bestimmt. Zusätzlich wurde die rex-abhängige aerobe Repression und Nitratrepression von alsS-lacZ gezeigt. Durch Microarray-Analysen wurde das AlsR-Regulon bestimmt. Neben der Regulation des alsSD Operons wurden vornehmlich Gene von AlsR reguliert, die an der Sporulation von B. subtilis beteiligt sind.
The B. subtilis alsSD operon encodes enzymes for acetoin biosynthesis and is regulated by the transcriptional regulator AlsR belonging to the LTTR family of transcriptional regulators. In this thesis AlsR was heterologously produced in a soluble form in E. coli. After purification and cleavage of the affinity- and solubility-tag a specific binding of AlsR to an alsSD promoter fragment was shown via gelretardation assays. Furthermore, DNaseI-protection analyses revealed the AlsR binding region in the promoter of the alsSD operon. Within this region, the sequence TAAT-N11-ATTA was identified as AlsR-box located at position -67 by using site directed mutagenesis followed by alsS-lacZ expression anaylsis. Acetate was postulated as an effector of AlsR due to an acetate-dependent induction of alsS-lacZ expression (Renna et al., 1993). Amongst others, the cytoplasmic pH, acetate and lactate were analyzed as potential effectors of AlsR. Determination of the intracellular pH (pHi) under fermentative growth conditions resulted in a pHi of 7.5 and under anaerobic growth conditions with 10 mM nitrate in a pHi of 7.4. Therefore the pHi was disproved as an effector for AlsR. Gelretardation assays in presence or absence of potential effectors did not lead to an altered binding affinity of AlsR to an alsSD promoter fragment. Additionally, in vitro transcription analyses in presence or absence of potential effectors did not lead to a change in alsS trancript amounts. Besides the postulated effector acetate lactate might be an effector of AlsR. The transcriptional start site of alsR was determined via primer extension analysis. Additionally a rex-mediated aerobic and nitrate repression for alsS-lacZ was shown. The AlsR regulon was determined via microarray analyses. Besides the alsSD operon the main part of the AlsR-regulated genes were involved in sporulation.
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