Preparation, validation and application of combinatorial phagemid libraries displaying large peptides
A phage display peptide library was created, which should possess the potential for formation of secondary structure in the library due to a length of 33 amino acids for the encoded peptides. This should allow for higher affinities to many various types of target molecules than that which is achieved by using common libraries of shorter peptides. The library was designed using the Cosmix-plexing method, which allows recombination of hyper-variable DNA regions. It uses type IIs restriction enzymes recognizing a defined DNA sequence, cutting in a fixed distance from that sequence. The enzyme can bind outside of the hyper-variable region which encodes the library diversity. This method can be applied to increase the diversity of the primary library, or to allow the recombination of different coding DNA cassettes of peptides from preselected populations which already showed affinity to a particular target, optimizing the binding capacities of these variants. The library was created using synthetic DNA and, together with a modified expression vector, assessed for its constitution. Furthermore, the Cosmix-plexing recombination method was validated and established for this library. Expression and presentation of the library peptides were validated, and the suitability of the library for screening was confirmed in affinity selection experiments. In a screening of the library for ligands binding to CD28, specific peptide variants were enriched and recombined using Cosmix-plexing. Indications of high affinity to CD28 (and of higher affinities for the recombined variants) could not be confirmed in BIAcore analysis. The inability to obtain clear evidence of affinity of the synthetic peptides was assumed to be due to difficulties in the chemical synthesis of such peptides which contained some very hydrophobic stretches. Some candidates have still not been successfully synthesized chemically.
Es wurde eine Phage Display-Peptid-Bibliothek erstellt, die durch eine Peptid-Länge von 33 Aminosäuren das Potential zur Ausbildung von Sekundärstrukturen besitzen soll. Diese Eigenschaft soll höhere Affinitäten zu einer Vielzahl verschiedener Zielmoleküle zulassen, als es bisher mit kürzeren Peptiden aus gängigen Peptid-Bibliotheken möglich ist. Die Bibliothek wurde mit Hinsicht auf die Methode des Cosmix-plexing entwickelt, welche Rekombination in hypervariablen DNA-Regionen erlaubt. Sie verwendet Typ IIs-Restriktionsenzyme, die eine definierte DNA-Sequenz erkennen, aber in definiertem Abstand von dieser schneiden. So kann die Bindung eines Restriktionsenzyms außerhalb der hochvariablen Region stattfinden, innerhalb welcher die Diversität der Bibliotheksstruktur kodiert ist. Mit dieser Technik kann man die Diversität der Ausgangsbibliothek steigern, oder die Rekombination verschiedener kodierender DNA-"Kassetten" von Peptiden aus vorselektierten Populationen vornehmen, die bereits eine Affinität für eine bestimmte Zieldomäne besitzen. So kann die Affinität der Varianten optimiert werden. Die aus synthetischer DNA erstellte Bibliothek wurde zusammen mit einem Expressionsvektor bzgl. ihrer Zusammensetzung untersucht und die Rekombinationsmethode des Cosmix-plexing validiert. Expression und Präsentation der Peptide wurden validiert, und die Eignung der Bibliothek für Screenings in Affinitätsanreicherungs-Versuchen bestätigt. In einem Screening der Bibliothek auf Liganden für CD28 wurden spezifische Peptide angereichert und mittels Cosmix-plexing rekombiniert. Die Hinweise darauf, dass diese Peptide hohe Affinitäten besitzen (und die rekombinierten Varianten höhere Affinitäten), konnten in BIAcore-Analysen nicht bestätigt werden. Die Schwierigkeiten beim Nachweis der Affinität der synthetischen Peptide liegen vermutlich in Limitierungen bei der chemischen Synthese begründet, da diese Peptide sehr hydrophobe Abschnitte aufweisen.
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