Nitrogenase-Like Enzymes of Chlorophyll and Bacteriochlorophyll Biosynthesis
Dark-operative protochlorophyllide oxidoreductase (DPOR) and chlorophyllide a oxidoreductase (COR) catalyze the stereospecific reduction of ring D and ring B during (bacterio)chlorophyll biosynthesis, respectively. Both enzymes show significant homology to the well-characterized nitrogenase complex, and are similarily composed of three protein subunits, namely BchN/ChlN, BchB/ChlB and BchL/ChlL (DPOR) and BchY, BchZ and BchX (COR), respectively. In this study, the DPOR enzymes of various organisms were biochemically characterized in detail. Catalytic activity of chimeric DPOR enzymes composed of subunits from different organisms (C. tepidum, P. marinus and T. elongatus) indicated a conserved interaction surface for protein-protein-interaction. The involvement of both subunits, ChlN and ChlB, in the interaction with the ChlL2 protein was shown. Important amino acid residues for catalysis and protein-protein-interaction of DPOR were identified. A second part of this study focused on the biochemical analysis of the COR enzyme from different organisms. Based on the activity of COR with substrate analogs, a flexibility in substrate recognition was deduced. While ring A and ring E composition revealed a degree of flexibility for COR catalysis, substituents on ring D were found specific for substrate recognition. To elucidate the potential evolution of the electron-transferring subunits of nitrogenase and nitrogenase-like enzymes, chimeric enzymes of DPOR, COR and nitrogenase were generated and investigated. While the failure to detect enzymatic activity for the chimeric enzyme of DPOR and nitrogenase indicates that both enzymes evolved significantly, the observed catalytic activity for the chimeric enzyme consisting of DPOR and COR suggests that subunits BchX2 and BchL2/ChlL2 have evolved only sparingly from a common ancestor.
Bei der Biosynthese von (Bakterio-)Chlorophyllen erfolgt die stereospezifische Reduktion von Ring B und D katalysiert durch die Licht-unabhängige Protochlorophyllid Oxidoreduktase (DPOR) und die Chlorophyllid a Oxidoreduktase (COR). Beide Enzyme zeigen hohe Homologie zur Nitrogenase und bestehen aus den drei Untereinheiten, BchN/ChlN, BchB/ChlB und BchL/ChlL (DPOR), bzw. BchY, BchZ und BchX (COR). Im Rahmen dieser Arbeit erfolgte eine detaillierte biochemische Charakterisierung von DPOR Enzymen aus verschiedenen Organismen. Aus der katalytischen Aktivität chimärer DPOR Enzyme verschiedener Organismen (C. tepidum, P. marinus und T. elongatus) konnte eine konservierte Interaktions-Oberfläche für die Protein-Protein-Interaktion abgeleitet werden. Darüber hinaus wurde die Beteiligung beider Untereinheiten, ChlN und ChlB, an der Interaktion mit dem ChlL2 Protein gezeigt. Basierend auf einer Mutagenese-Studie wurden außerdem wichtige Aminosäure-Reste der DPOR Untereinheiten für die Katalyse und Protein-Protein-Interaktion der DPOR bestimmt. Im zweiten Teil der Arbeit erfolgte die biochemische Analyse der COR aus verschiedenen Organismen. Basierend auf der Aktivität des Enzyms mit Substratanaloga konnte eine Flexibilität bei der Substraterkennung abgeleitet werden. Dabei werden sowohl an Ring A als auch an Ring E Modifikationen toleriert, während für die Substituenten an Ring D eine Spezifität für die Substraterkennung gezeigt werden konnte. Um die Evolution der Elektronen-transferierenden Untereinheiten von Nitrogenase und Nitrogenase-ähnlichen Enzymen zu untersuchen, wurden chimäre Enzyme aus DPOR, COR und Nitrogenase analysiert. Während chimäre Enzyme aus DPOR und Nitrogenase keine Aktivität zeigten und sich somit im Laufe der Evolution signifikant veränderten, deutet die Aktivität für chimäre Enzyme aus DPOR und COR darauf hin, dass sich die beiden Untereinheiten BchL2/ChlL2 der DPOR und BchX2 der COR nur gering aus einem gemeinsamen Vorläuferenzym entwickelt haben.
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