Hyperforin-Biosynthese : cDNA Klonierung der Isobutyrophenon-Synthase aus Hypericum perforatum und H. calycinum

Zubereitungen aus Hypericum perforatum L. werden zur Behandlung leichter bis mittelschwerer Depressionen eingesetzt. An ihrer Wirkung ist das Phoroglucin-Derivat Hyperforin als Wiederaufnahme-Hemmer von Neurotransmittern beteiligt. Das Grundgerüst des Hyperforins wird von einer Typ III Polyketid-Synthase (PKS III), der Isobutyrophenon-Synthase (BUS) gebildet, die Isobutyryl-CoA als Startersubstrat mit drei Molekülen Malonyl-CoA kondensiert. Weitere Vertreter der PKS III-Enzymfamilie sind Chalkon-Synthase (CHS) und Benzophenon-Synthase (BPS), die 4-Cumaroyl-CoA bzw. Benzoyl-CoA als Startermoleküle mit Malonyl-CoA zu Naringenin-Chalkon (Flavonoid-Biosynthese) bzw. Phlorbenzophenon (Xanthon-Biosynthese) umsetzen. cDNAs für CHS und BPS wurden aus H. perforatum und H. calycinum in unserer Arbeitsgruppe bereits kloniert und charakterisiert. Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist die cDNA-Klonierung und funktionelle Expression der BUS. Aus Adhyperforin-produzierenden Zellkulturen von H. calycinum sowie aus intakten Pflanzen von H. calycinum und H. perforatum wurde poly(A+)-RNA isoliert und in cDNA revers transkribiert. Für die Amplifikation von PKS III-Fragmenten wurden degenerierte Primer entworfen, die sich von konservierten Regionen bekannter PKS III-Sequenzen ableiten. Durch PCR wurden drei cDNA-Fragmente gewonnen, die 79 - 85% Identität mit PKS III in der Datenbank aufweisen. Mittels 3´-RACE PCR wurden die Klone stromabwärts vervollständigt. Die anschließende 5´-RACE PCR konnte bislang ein cDNA-Fragment in einen Volllänge-Klon überführen. Zur Zeit wird durch Expression in E. coli geprüft, ob der ORF für BUS kodiert.