Structural Analysis of the L-Ornithine N5-Monooxygenase SidA from Aspergillus spp.
In the present study the L-ornithine N5-monooxygenase (SidA), a key enzyme of the Aspergillus siderophore biosynthesis pathway, has been recombinantly expressed, purified and crystallized for subsequent X-ray analysis and structure solution. Thereby SidA variants from two Aspergillus strains, A. fumigatus and A. nidulans, were tested with regards to crystallizability and X-ray diffraction potential. In the course of the present project the SidA from A. nidulans proved to be more suitable for crystallization than the orthologous enzyme from A. fumigatus. Therefore attempts to solve the SidA crystal structure were continued on the A. nidulans protein. However, despite various efforts to improve the quality of the obtained SidA crystals, their X-ray diffraction potential could only be improved to a maximum resolution of 3.2 Å. Finally, using a crystal of selenomethionine (SeMet)-derivatized SidA, initial phase information was obtained by the multiple-wavelength anomalous dispersion (MAD) technique. A first structural model of SidA has been built on basis of the SeMet-derived phases. Though partly fragmentary, the crystal structure obtained so far displays a typical flavin-oxidoreductase fold and has a topology that closely resembles that of the flavin monooxygenase from Methylophaga sp. The described biochemical and structural results obtained within this work represent a promising basis for future works on SidA as well as on structurally and functionally related enzymes.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde ein Schlüsselenzym der Aspergillus-Siderophorbiosynthese, die L-Ornithin N5-Monooxygenase (SidA), rekombinant exprimiert, aufgereinigt und kristallisiert, um anschließend eine Strukturbestimmung mittels Röntgendiffraktion durch zu führen. Dabei wurden SidA-Varianten aus zwei Aspergillus-Arten, A. fumigatus und A. nidulans, im Hinblick auf Kristallisationsvermögen und Röntgendiffraktionspotenzial getestet. Da sich das Protein aus A. nidulans besser kristallisieren ließ als die orthologe SidA-Variante aus A. fumigatus, wurden alle weiteren Experimente ausschließlich mit dem Protein aus A. nidulans durchgeführt. Trotz zahlreicher Versuche, die Qualität dieser SidA-Kristalle zu optimieren, konnte in anschließenden Röntgendiffraktionsexperimenten nur eine maximale Auflösung von 3.2 Å erzielt werden. Zur initialen Phasenbestimmung wurde schließlich ein Kristall eines Selenomethionin (SeMet)-Derivats von SidA hergestellt und die Methode der multiplen anomalen Dispersion (MAD) angewendet. Auf Basis der so erhaltenen Phaseninformation konnte schließlich ein erstes Strukturmodell von SidA erstellt werden. Obgleich die derzeitige SidA-Struktur teilweise fragmentarisch ist, weist sie die für Flavinoxidoreduktasen typische Faltung auf und ist darüber hinaus in ihrer Topologie der Flavinmonooxygenase aus Methylophaga sp. sehr ähnlich. Sowohl die in dieser Arbeit beschriebene Struktur als auch die Ergebnisse der biochemischen Experimente sind eine vielversprechende Grundlage für zukünftige Untersuchungen an SidA und strukturell wie funktionell verwandten Enzymen.
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