Präzision in der Gelelektrophorese für die Pharmazeutische Qualitätskontrolle
Die Gelelektrophorese (GE) ist bekannt für ihre unzureichende Präzision. In quantitativen Analysen werden relative Standardabweichungen (RSD%) von bis zu 60% erhalten. Eine Verbesserung der Präzision und der Empfindlichkeit für die Detektion von Proteinen ist somit unbedingt notwendig, besonders im Bereich der pharmazeutischen Qualitätskontrolle von biopharmazeutischen Arzneimitteln. Als Hauptfehlerquellen für die unzureichende Präzision wurden das Sichtbarmachen bzw. die Detektion der getrennten Proteine, der Transfer der Proteine von der ersten auf die zweite Dimension (2-DE) sowie die Erfahrung des Analytikers identifiziert. Starke Schwankungen in der Gelhintergrundfärbung, die sich in der stark schwankenden Basislinie äußern, stellen die Hauptfehlerquelle dar. Das Hintergrundsignal kann durch die Detektion der Proteine im Nahen-Infrarot-Wellenlängenbereich extrem reduziert werden. Diese Detektionsmethode stellt die zurzeit empfindlichste Detektion für konventionelle Coomassie gefärbte Gele dar, was sich in einer quantitativen Reproduzierbarkeit von 3-10% RSD% äußert. Eine weitere Alternative ist die Detektion aufgrund der Nativen Fluoreszenz der Proteine. Gut definierte Peaks und ein dreifach besseres Signal-zu-Rausch Verhältnis, obwohl die Probe in einer 800-fach geringeren Konzentration eingesetzt wurde, führen zu einer Verbesserung der Präzision von 12-16% RSD%. Für die Untersuchung weiterer Varianzkomponenten wurde ein Plackett-Burman Screening-Versuchsdesign mit Proteinen unterschiedlicher Eigenschaften durchgeführt. Für jedes Protein wurden unterschiedliche Einflussfaktoren als signifikant identifiziert. Nur vier der sieben untersuchten Faktoren zeigten jedoch einen signifikanten Effekt auf einige der untersuchten Proteine. Somit kann eine Verbesserung der Präzision nur individuell für die einzelnen Proteine erfolgen. Ein größeres Verständnis über die Einzigartigkeit der Proteine ermöglicht eine weitere Verbesserung der Präzision in der GE.
Gel electrophoresis (GE) is known for its often unsatisfactory precision. In quantitative analysis percental relative standard deviations (RSD%) up to 60% have been reported. Thus, an improvement of precision and sensitivity is absolutely essential for protein detection using GE, especially for the quality control of pharmaceuticals. Potential major sources of variability for this technique include staining or rather detection of separated proteins, the transfer between the first and the second dimension (2-DE) and the analyst’s expertise. The remarkable and completely irregular changes of the background signal from gel to gel were identified as one of the governing error sources. These background changes can be strongly reduced by using a signal detection in the near-infrared range. This detection method provides the most sensitive approach for conventional Coomassie stained gels which is reflected in a total error of just 3-10% RSD% with a quite good signal-to-noise ratio for simple one-dimensional separations. A further alternative is the direct detection of separated proteins by utilising their native fluorescence. Well-defined peaks and a threefold better signal-to-noise ratio were found compared to conventional fluorescence or Coomassie staining, although the sample was used in an 800-fold lower concentration. These resulted in a better quantitative spot reproducibility of approx. 12-16% RSD%. In order to investigate further variance components, an experimental Plackett-Burman screening design was performed using proteins with different properties. Completely different factors were identified to be significant for each protein. Out of seven investigated parameters, just four showed a significant effect on some proteins. Precision can only be improved individually for each protein. A more understanding of the unique properties of proteins should enable us to further improve precision in GE.
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