Functional knockdown of surface VCAM-1 at the posttranslational level with ER-retained antibodies
The knockdown of proteins allows the study of protein functions in vitro and in vivo. Although RNA interference (RNAi) can be used for this purpose on the posttranscriptional level, knockdown strategies using intracellular antibodies (intrabodies) are an alternative acting on the posttranslational level. This study presents the first functional knockdown of vascular cell adhesion molecule (VCAM-1) that is achieved by co-expression of VCAM-1 specific intrabodies. Therefore, a mammalian expression vector was generated encoding a VCAM-1 specific single chain variable fragment (scFv) genetically fused to the sequence KDEL, which leads to retention of the protein inside the endoplasmic reticulum (ER) of the cell. Transient transfection of VCAM-1 positive cells with this expression plasmid revealed a downregulation of VCAM-1 from the cell surface determined by flow cytometry and fluorescence microscopy. The knockdown of surface VCAM-1 was time-dependent and almost complete. Furthermore, intrabody mediated knockdown also impaired cell-cell interaction of formerly VCAM-1 positive cells with Jurkat lymphoma cells. These are endogenously expressing very late antigen (VLA-4), a physiological binding partner of VCAM-1. Finally, colocalization of the retained VCAM-1 antigen and the co-expressed VCAM-1 specific intrabodies was analyzed by confocal microscopy, supporting the hypothesis that specific interaction of antigen and intracellular antibody downregulates the surface protein. Taken together, posttranslational knockdown of surface proteins by co-expression of ER-retained intrabodies is a promising technique, as shown here for the cell adhesion molecule VCAM-1.
Der Knockdown von Proteinen erlaubt die Analyse der Protein-Funktionen in vitro und in vivo. Die Methode der RNA-Interferenz (RNAi) kann zu diesem Zweck auf posttranskriptionaler Ebene benutzt werden, wohingegen Knockdown-Strategien mittels intrazellulärer Antikörper (intrabodies) eine Alternative sind, die auf posttranslationaler Ebene wirkt. Das Ziel dieser Arbeit war der funktionelle Knockdown des Oberflächenproteins VCAM-1 (vascular cell adhesion molecule) durch Koexpression von VCAM-1-spezifischen intrazellulären Antikörpern. Es wurde ein Expressionsvektor konstruiert, der ein Antikörperfragment gefolgt von einer C-terminalen KDEL-Sequenz kodierte, die für den Verbleib des Proteins im endoplasmatischen Retikulum (ER) der Zelle verantwortlich ist. Nach einer transienten Transfektion von VCAM-1 positiven Zellen mit diesem Plasmid konnte mittels Durchflusszytometrie und Fluoreszenzmikroskopie eine Herunterregulierung des VCAM-1 Oberflächenproteins gezeigt werden. Der Knockdown von VCAM-1 war zeitabhängig und nahezu vollständig. Außerdem führte der Knockdown von VCAM-1 zu einer geringeren Bindung von zuvor VCAM-1 positiven Zellen an Jurkat-Zellen. Diese exprimieren das Integrin VLA-4 (very late antigen) endogen, den physiologischen Interaktionspartner von VCAM-1. Schließlich konnte mittels konfokaler Mikroskopie die Kolokalisation des intrazellulären VCAM-1 Antigens und des koexprimierten VCAM-1-spezifischen Antikörpers gezeigt werden. Diese Kolokalisation unterstützt die Hypothese, dass die spezifische Interaktion zwischen Antigen und intrazellulärem Antikörper zu einer Herunterregulierung des Oberflächenproteins führt. Zusammenfassend scheint der posttranslationale Knockdown von Proteinen durch Koexpression von intrazellulären Antikörpern eine vielversprechende Methode zu sein, die hier anhand des Zelladhäsions-Moleküls VCAM-1 gezeigt wurde.
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