High-throughput metabolome analysis of transposon mutants of Corynebacterium glutamicum and Quenching of microbial metabolism
A suitable method is the prerequisite for comprehensive screening performances. Therefore, an analytical method for high-throughput metabolome analysis on basis of our well established standard method was developed. Fast metabolome analysis was done using gas chromatography/mass spectrometry. Two major advantages were parallelization of operations and partial automation. In short this means a clear reduction of time needed for the pre-analytical steps. The standard error between independent samples of the model organism Corynebacterium glutamicum raised on the same plate was decreased to 13%. Additionally, the runtime of a single measurement was decreased, allowing an increased number of measurements per day. The adaptation of our internal standard library achieved 650 quantifiable peaks per single GC/MS run. With this method around 320 transposon mutants of Corynebacterium glutamicum were investigated, and suitable screening criteria were developed to identify mutants with significant changes of their phenotype. First indicators regarding this research came from a comparison of mutant and wild type raised on the same plate. But for a clear differentiation of changes caused by gene deletion and those resulting from biological and environmental variations, a wild type reference list was created. A threshold for each metabolite was calculated revealing significant differences. The last part of this thesis deals with the development of a quenching method applicable for different microorganisms. An ethanol quenching procedure, established earlier in our group, was optimized, and evaluated against results coming from published quenching tests for three different organisms: Corynebacterium glutamicum, Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae. The ethanol quenching method in most cases produced the highest number of detected metabolites, and had a low standard error. Also, this samples showed the highest range of relative concentrations of identified metabolites.
Ein umfassendes und erfolgreiches Screening ist nur mit einer geeigneten Methode möglich. Deshalb wurde im Rahmen dieser Arbeit eine Hochdurchsatzmethode zur Metabolomanalyse entwickelt. Grundlage war die Standardmethode unserer Arbeitsgruppe. Die Metabolomanalyse wurde unter Verwendung der Gaschromatographie/Massen-spektrometrie durchgeführt. Hauptvorteile waren Parallelisierung und Teilautomatisierung, die zu einer Verringerung der benötigten Zeit für die Probenvorbereitung führten. Der Standardfehler unabhängiger Proben des Modellorganismus Corynebacterium glutamicum wurde auf 13% reduziert. Außerdem wurde die Laufzeit einer Messung verkürzt und so die Anzahl pro Tag erhöht. Die Anpassung unserer internen Standardbibliothek führte zu 650 quantifizierbaren Peaks je GC/MS-Lauf. Diese Methode wurde verwendet, um zirka 320 Transposonmutanten von Corynebacterium glutamicum zu untersuchen und geeignete Kriterien für das Screening nach Mutanten mit signifikanten Veränderungen des Phänotyps zu entwickeln. Zuerst erfolgte der direkte Vergleich gemeinsam kultivierter Mutanten- und Wildtypproben. Allerdings konnte nicht zwischen Veränderungen durch Gendeletion und biologischen und umweltbedingten Schwankungen unterschieden werden. Deshalb wurde eine Referenzliste erstellt. Die Ermittlung eines für jeden Metaboliten spezifischen Schwellenwerts ließ signifikante Veränderungen erkennen. Im letzten Teil der Arbeit wurde eine Quenchingmethode für unterschiedliche Mikro-organismen untersucht. Dafür wurde eine bereits vorhandene Ethanolquenchmethode unserer Arbeitsgruppe optimiert und an verschiedenen Organismen - Corynebacterium glutamicum, Escherichia coli und Saccharomyces cerevisiae - sowie im direkten Vergleich zu publizierten Methoden evaluiert. Das Quenchen mit Ethanol lieferte in den meisten Fällen die höchste Anzahl sowie die höchsten relativen Konzentrationen identifizierter Metabolite verbunden mit geringen Standardfehlern.
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