Rekombinante Antikörper für "Lab-on-chip"

Das C-reaktive Protein (CRP) ist ein wichtiger Marker für bakterielle Entzündungen und wird in der Blutserumdiagnostik zeit- und kostenaufwändig in Zentrallaboratorien bestimmt. Gleichzeitig besteht aber auch der Bedarf nach einem point-of-care Mikroanalysesystem für die schnelle CRP-Diagnostik unmittelbar am Patienten, beispielsweise während einer Operation, am Krankenhausbett oder auch zu Hause bei ambulanter Behandlung. Bisher entwickelte CRP-Diagnostiksysteme basieren auf CRP-spezifischen Antikörpern aus Hybridomzellen oder Immunbibliotheken. Dabei fehlen Untersuchungen zur Antikörperstabilität, ein entscheidender Parameter für die spätere Lagerung und Regenerierung des fertigen klinischen Analysesystems. Die in dieser Arbeit aus den semisynthetischen Antikörpergen-Bibliotheken Tomlinson I und J isolierten CRP-spezifischen single chain Fv (scFv)-Antikörperfragmente sind für den Einsatz in mikrofluidische Analysesysteme geeignet. Sie wurden hinsichtlich Affinität und Stabilität sowie ihrer Antigenbindestelle (Epitop) charakterisiert und können aufgrund ihrer hohen Stabilität ohne signifikanten Funktionalitätsverlust für mehr als 2 Wochen bei 37 °C gelagert werden, besitzen eine hohe Affinität im nanomolaren Bereich (1,1 - 2,7 x 10-8 M) und eignen sich für den qualitativen Nachweis von CRP mittels eines Fließsystems. Die hier isolierten und charakterisierten Antikörperfragmente erkennen spezifisch natives CRP als auch partiell denaturiertes Neo-CRP. Die Implementierung der CRP-spezifischen Antikörper in den Quarz-Mikrosensor wurde hinsichtlich Antikörperformat, chemischer Kopplungsmethode und Absättigungsreagenz in goldbeschichteten Mikrotiterplatten optimiert, diese Parameter wurden bereits auf dem mikrofluidischen Quarzsensor umgesetzt. Dabei erfolgten Messungen von reinen CRP-Lösungen auf dem Quarzmikrosensor, nach sechs Regenerationsschritten kam es weiterhin zu einer gleichbleibend sensitiven und spezifischen Detektion von CRP. Mit diesen Messungen wurde erstmals der Einsatz CRP-spezifischer scFv-Antikörperfragmente aus einer semisynthetischen Antikörpergen-Bibliothek in einem Immunosensor, das wiederholte Messungen von CRP in einem konstanten Fluß ermöglicht, gezeigt. Damit gelang die erfolgreiche Isolation und zusätzliche Charakterisierung CRP-spezifischer Antikörperfragmente für die Entwicklung eines quarzbasierten Immunosensors, mit dem sich Blutserumanalysen direkt am Patienten mit einem geringem Zeitaufwand durchführen lassen können.