Capillary Electrophoresis for Protein Analysis Strategies to Prevent Protein Adsorption and Method Development Using Coated Capillaries for Electrophoresis
In order to prevent protein adsorption on the capillary surface and increase the reproducible protein analysis, some strategies were applied in capillary zone electrophoresis (CZE) and isoelectric focusing (CIEF). Three model proteins were used: cytochrome c (basic), ß-lactoglobulin (acidic) and ß-casein (more easily denaturing). The application of polydimethylacrylamide as a coating for silica offers better reproducibility of the apparent EOF mobility compared to bare fused-silica capillaries and good stability in long-term protein separation. Poly(ethylene glycol) 32 mg/mL was proven as an effective substance to stabilize the proteins native state and coat the bare fused-silica capillary surface (RSD%<2%). Hydrochloric acid 2M was investigated as rinsing reagent to remove adsorbed proteins from linear polyacrylamide (LPA)-coated capillaries after every 10th run. Good repeatability of the apparent EOF mobility was achieved with RSD%<3%. Only very high concentrations (175 µM) of ß-lactoglobulin and ß-casein at pH 3.5 gave RSD%>5%. For these conditions, the further test of 85%(m/m) phosphoric acid as rinsing reagent showed good results. Hydrochloric acid 3M was also investigated to improve the precision on protein analysis using LPA-coated capillaries in CIEF. It was performed after each run. Further improvements in precision have been obtained by avoiding a complete stand still of liquid within the capillary when the separation system was idle. Pressure and high voltage were applied to prevent assumed bulged structures on the coated capillaries during storage. Consecutive runs without capillary storage and decreasing the focusing time can also reduce the protein precipitation during routine analysis. Good reproducibility of migration time and peak area was achieved with RSD%≤5%.
Um Proteinadsorption an der Kapillaroberfläche zu verhindern und die Reproduzierbarkeit der Proteinanalyse zu verbessern, wurden verschiedene Strategien für Kapillar-Zonenelektrophorese (CZE) und Kapillar-Isoelektrische Fokussierung (CIEF) untersucht. Drei Modellproteine wurden benutzt: Cytochrom c (basisch), β-Lactoglobulin (sauer) und β-Casein (leicht denaturierend). Polydimethylacrylamid-beschichtete Kapillaren boten gegenüber den unbeschichteten eine bessere Reproduzierbarkeit der scheinbaren Mobilität des elektroosmotischen Flusses (EOF) und hohe Stabilität für die Proteinanalyse über einen langen Zeitraum. Polyethylenglycol (32 mg/mL) erwies sich als effektives Reagens zur Stabilisierung der Proteine im nativen Zustand wie zur Beschichtung der Kapillaroberfläche (RSD%<2%). Salzsäure (2M) wurde als Spüllösung verwendet, um adsorbierte Proteine von einer mit linearem Polyacrylamid (LPA) beschichteten Kapillarwand zu entfernen. Dabei wurde eine gute Reproduzierbarkeit der scheinbaren EOF-Mobilität erreicht (RSD%<3%). Nur sehr hohe Konzentrationen (175 µM) von β-Lactoglobulin und β-Casein bei pH 3,5 ergaben RSD%-Werte>5%. Hier lieferte die Verwendung von Phosphorsäure 85%(m/m) gute Ergebnisse. Salzsäure (3M) wurde außerdem benutzt, um die Präzision der CIEF in LPA-beschichteten Kapillaren zu erhöhen, wobei die Spülungen nach jedem Lauf durchgeführt wurden. Durch Anlegen von Druck und Hochspannung während der Leerlaufzeiten wurde ein Stillstand der Flüssigkeit in der Kapillare vermieden, was die Präzision zusätzlich steigerte. Dies wirkt auch der Bildung von Auswölbungen in der beschichteten Kapillarwand entgegen, die vermutlich während der Lagerung der Kapillare entstehen. Fortlaufende Analysen ohne Lagerung der Kapillare und eine reduzierte Fokussierungszeit konnten die Ablagerung von Proteinen während der Routineanalyse ebenfalls verhindern. Eine gute Reproduzierbarkeit von Migrationszeit und Peakfläche (RSD%≤5%) wurde erreicht.
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