Electron Transport Chain Coupled Protoporphyrinogen IX Oxidase from Escherichia coli
The penultimate step of heme biosynthesis – the conversion of protoporphyrinogen IX into protoporphyrin IX – is catalysed by protoporphyrinogen IX oxidases (PPOs). While the oxygen-dependent enzyme system of eukaryotes and Gram positive bacteria is well investigated, little was known about the oxygen-independent PPO found in facultative and anaerobic organisms. In this work, the oxygen-independent PPO of E. coli was identified. PPO activity was localised in and extractred from the membranes of E. coli. The PPO activity was chromatographically purified and obtained fractions examined for the protein content. The protein HemG was repeatedly found. B. megaterium, devoid of detectable oxygen-independent PPO activity, was used to recombinantly produce HemG. Afterwards, oxygen-independent PPO was detected, establishing HemG as the oxygen-independent PPO of E. coli. HemG was chromatographically purified and biochemically characterised. A FMN cofactor was identified by HPLC analysis. Gel permeation chromatography indicated a hexameric conformation of native HemG. Kinetic data was obtained, yielding a K(m) value of 17.3 µM and a maximal velocity rate of 16 µM min(-1) mg(-1) HemG. The proposed electron transfer properties towards the respiratory chains were investigated. First, menaquinone and ubiqinone were shown to be able to take up electrons from HemG. Then, purified fumarate reductase, nitrate reductase and cytochrome bo and bd oxidase were found to transfer electrons to the terminal electron acceptors fumarate, nitrate and oxygen. In vivo investigations using E. coli mutants devoid of terminal oxidases confirm the in vitro findings. Since oxygen is an indirect electron acceptor of the PPO reaction in E. coli, it is suggested to use the term “electron transport chain coupled” PPO.
Der vorletzte Schritt in der Hämbiosynthese – die Umsetzung von Protoporphyrinogen IX zu Protoporphyrin IX – wird von Protoporphyrinogen IX Oxidasen (PPOs) katalysiert. Die sauerstoffabhängige PPO der Eukaryoten und Gram positiven Bakterien wurde bereits eingehend untersucht. Nur sehr wenig war über das sauerstoffunabhängiges System in fakultativen und anaeroben Organismen bekannt. In dieser Arbeit wurde die sauerstoffunabhängige PPO von E. coli identifiziert. PPO-Aktivität wurde die in der Cytoplasmamembran lokalisiert und extrahiert. Die Aktivität wurde chromatographisch gereinigt und erhaltene Fraktionen auf ihre Proteinzusammensetzung überprüft. Hierbei wurde mehrfach das Protein HemG gefunden. HemG wurde in Bacillus megaterium, ein Organismus ohne detektierbare sauerstoffunabhängige PPO-Aktivität, rekombinant produziert. Hiernach wurde sauerstoffunabhängige PPO-Aktivität detektiert, was HemG als die sauerstoffunabhängige PPO von E. coli etabliert. HemG wurde chromatographisch gereinigt und biochemisch charakterisiert. Ein FMN Co-Faktor wurde mittels HPLC-Analysen identifiziert. Eine Gelpermeationschromatographie deutet auf eine hexamere Konformation des nativen Enzyms. Kinetische Daten wurden erhoben, wonach sich ein K(m) von 17,3 µM und V(max) von 16 µM min(-1) mg(-1) HemG ableitete. Es wurde nachgewiesen, das während der Reaktion Ubichinon und Menachinon Elektronen von HemG aufnehmen. Experimente mit gereinigter Fumaratreduktase, Nitratreduktase bzw. den Cytochrom Oxidasen bd und. bo zeigten, dass Elektronen über diese Enzyme auf die terminalen Elektronenakzeptoren Fumarat, Nitrat bzw. Sauerstoff übertragen werden. In vivo-Studien mit Mutanten defizient in terminalen Oxidasen bestätigten die in vitro-Ergebnisse. Da Sauerstoff indirekter Elektronenakzeptor in der PPO-Reaktion in E. coli ist, wird vorgeschlagen dieses Enzym „elektronentransportketten-gekoppelte PPO“ zu nennen.
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