Untersuchung von kupferhaltigen Aminoxidasen aus Pyrrolizidin-Alkaloid-produzierenden Pflanzen

Zu den Sekundärstoffwechselprodukten zählen die Pyrrolizidin-Alkaloide (PAs). Sie werden von einigen wenigen Pflanzen zur Verteidigung gegen Herbivoren konstitutiv gebildet. Es sind Esteralkaloide, die aus einer Necinbase und einer Necinsäure aufgebaut sind. Die Bildung der Necinbase in der PA-Biosynthese ist bis zur Homospermidinsynthase aufgeklärt worden. Diese verbindet den Primär- mit dem Sekundärstoffwechsel und bildet aus Putrescin und Spermidin Homospermidin (Hspd). Die weiteren Schritte bzw. Enzyme zur Bildung der Necinbase sind noch nicht aufgeklärt worden. Man nimmt an, dass es sich bei dem Hspd-umsetzenden Enzym um eine kupferhaltige Aminoxidase (CAO) handelt. Um das Hspd-umsetzende Enzym zu identifizieren, wurden die PA-Pflanzen Senecio vernalis und Eupatorium cannabinum mit verschiedenen Methoden untersucht. Es wurden drei CAO-homologe Sequenzen in S. vernalis und eine CAO-homologe Sequenz/ein CAO-homologes 3'Ende in E. cannabinum mit Hilfe der PCR-Techniken identifiziert. Nach Klonierung und heterologen Expression von zwei S. vernalis-Sequenzen in E. coli sind Inclusion bodies entstanden. Zur Gewinnung von aktivem Protein wurde die Expression in Pichia pastoris, die Co-Expression mit Chaperonen sowie die Solubilisierung und Rückfaltung der Inclusion bodies angewandt. Es wurde ein radioaktiver Aktivitätstest für CAOs etabliert. Dabei stellte sich ein großer Einfluss von Wasserstoffperoxid und Sauerstoff heraus. Über Signalpeptidanalyse wurden die drei S. vernalis-Sequenzen in den Peroxisomen in der Zelle lokalisiert. Mit der FPLC wurden Hspd-umsetzende Enzyme aus Wurzelrohextrakten angereinigt. Weitere Strategien wie Laser-Capture-Microscopy und differentielle PCR in Kombination mit Western-Blot-Analyse wurden angetestet.