Fluoreszierende Insulin-Fusionsproteine zur Beurteilung des Granulationsstatus und der Exozytose von insulinproduzierenden Zellen
Die Mechanismen der Glucose-induzierten Insulinsekretion sind im Bereich der KATP-Kanal-unabhängigen Signaltransduktion nur unvollständig verstanden. Diskrepanzen zwischen Änderungen der cytosolischen Calciumkonzentration und der tatsächlich gemessenen Sekretion lassen sich am ehesten mit einem unterschiedlichen Bestand an sekretionsbereiten Granula erklären. Insofern ergab sich als primäre Aufgabenstellung für diese Arbeit die Entwicklung eines spezifischen Labels für die Insulin-Sekretgranula, wodurch es möglich sein sollte, den gesamten Granulabestand von B-Zellen und, bei Verwendung der TIRF-Mikroskopie, die membranassoziierten und damit unmittelbar sekretionsbereiten Granula zu quantifizieren. Die Markierung der Insulingranula gelang mit einem Fusionsprotein aus dem humanen Präproinsulin und C-terminalem EGFP, die über einen „Spacer“ von sieben Aminosäuren miteinander verbunden waren. Die bei transient transfizierten insulinproduzierenden Zelllinien zu beobachtende granuläre Fluoreszenz blieb auch bei Permeabilisierung der Plasmamembran erhalten. Darüber hinaus konnte mittels TIRF-Mikroskopie gezeigt werden, dass die fluoreszierenden Granula auf eine Kalium-Depolarisation mit vermehrter Bewegung und einer Änderung der Fluoreszenzemission reagierten. Diese Änderung war nicht bei allen Granula gleichartig, deutlich vorherrschend war jedoch eine vorübergehende Intensivierung und danach Verlöschen der Fluoreszenz. Aufgrund dieser Erfahrungen wurden zwei weitere Insulin-Fusionsproteine generiert, eines, an dessen C-terminalen Ende der A-Kette das rot fluoreszierende tdimer Protein gebunden war, und eines, bei dem sich an der gleichen Stelle das sogenannte timer-Protein befand. Mit allen drei Konstrukten (Insulin-EGFP, Insulin-tdimer und Insulin-timer) wurden stabil transfizierte insulinproduzierende Zelllinien (MIN6-Zellen) sowie lentivirale Vektoren hergestellt und das Verhalten der transfizierten MIN6-Zellen und primären B -Zellen charakterisiert.
The mechanisms of glucose-induced insulin secretion are still incompletely understood, in particular the KATP channel-independent signalling pathway. Discrepancies between the increase in cytosolic calcium concentration and the expected increase in secretion may be due to a variable availability of secretion-ready granules. Thus the primary task of this thesis work was to develop a specific label for insulin granules which should enable us to observe the kinetics of the total B-cell granule content, and, by use of the TIRF microscopy, to quantify the membrane-associated, secretion ready-granules. The labelling of the insulin granules was achieved by generating a fusion protein of the human preproinsulin and a c-terminally linked EGFP, which were linked by a spacer of seven amino acids. Transiently transfected insulin-producing cells showed a granular green fluorescence, which remained stable after digitonin permeabilization. By use of TIRF-microscopy an intensified movement in response to a potassium depolarization and a change in fluorescence intensity became visible. The response was not homogeneous with all granules, however, a transient increase followed by a disappearance clearly predominated. Based on this experience two further fluorescent insulin fusion proteins were generated. One contained the red fluorescent tdimer protein at the c-terminus of the A-chain, the other contained at this site the “timer” protein, which time-dependently changes its fluorescence from green to red. With all three of these constructs stably transfected insulin-producing cell lines and lentiviral vectors were generated. Finally, the responsiveness of the cell lines and of the infected primary B-cells was functionally characterized.
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