Ortsgerichtete Mutagenese der Benzophenonsynthase von Hypericum androsaemum

Klundt, Tim

doi:10.24355/dbbs.084-200807100200-3

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Ortsgerichtete Mutagenese der Benzophenonsynthase von Hypericum androsaemum

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In dieser Arbeit wurden Untersuchungen des Reaktionsablaufs zu dem Enzym Benzophenonsynthase (BPS) durchgeführt. Dieses Enzym akzeptiert als Startersubstrat Benzoyl-CoA und verlängert dieses mit drei C2-Einheiten aus Malonyl-CoA zu einem Tetraketid. Nach anschließender Zyklisierung sowie einer Claisen-Kondensation entsteht das Hauptprodukt 2,4,6-Trihydroxybenzophenon. Die BPS wurde in E. coli exprimiert und mit Hilfe von molekularbiologischen Methoden eine Reihe von Punktmutationen eingeführt. Durch Punktmutation gelang es eine Enzymmutante zu erstellen, die eine veränderte Substrat- und Produktspezifität aufweist. Sie wurde so verändert, dass an der Aminosäurensequenzposition 135 ein Threonin gegen ein Leucin ausgetauscht wurde. Die Produktspezifitätsänderung zeigt sich dadurch, dass diese Mutante nach Inkubation mit Benzoyl-CoA und Kettenverlängerung mit Malonyl-CoA nicht mehr das Tetraketid Benzophenon bildet, sondern nur noch ein Triketid, welches zum Phenylpyron laktonisiert wird. Zusätzlich gelang es durch diese Mutation die Substratspezifität so zu ändern, dass für das Substrat 3-Hydroxybenzoyl-CoA, welches zuvor hohe Aktivität mit dem Wild-Typ aufwies, keine Aktivität mehr gezeigt werden konnte. Durch Homologiemodellierung auf der Basis der Röntgenstruktur der verwandten Chalkonsynthase aus Medicago sativa konnten Rückschlüsse auf den nun veränderten Reaktionsablauf im aktiven Zentrum des Enzyms sowohl im Wild-Typ als auch in der Mutante gezogen werden. Im Strukturmodell der Mutante T135L wurde eine zusätzliche Bindetasche identifiziert, die in der Lage ist, das entstehende Triketid mit hoher Affinität zu binden und so die weitere Kettenverlängerung zu verhindern. Durch anschließende kinetische Charakterisierung zeigte sich, dass sowohl die Benzophenonsynthase als Wild-Typ als auch ihre Mutante vergleichbare katalytische Effizienzen besitzen und somit gezeigt werden konnte, dass eine Benzophenonsynthase in eine Phenylpyronsynthase umgewandelt werden kann.

In this work the reaction mechanism of the enzyme benzophenone synthase (BPS) has been investigated. This enzyme accepts Benzoyl-CoA as the main starting substrate which is elongated with three C2 units from malonyl-CoA to form a tetraketide. After a subsequent cyclization and claisen condensation the main product 2,4,6-trihydroxybenzophenone is formed. The BPS was expressed in E. coli and a series of point mutations was introduced by molecular biology techniques. By taking this approach a mutation of the enzyme with different substrate und product specificity was created, replacing threonine by leucin in position 135. The mutant shows different product specificity: the tetraketide related benzophenone was no longer formed after incubation with benzoyl-CoA and chain elongation with malonyl-CoA but a triketide that leads to the formation of phenylpyrone after a lactonization step. In addition to that the mutant showed no measurable activity with 3-hydroxybenzoyl-CoA, which was an efficient substrate for the wild-type enzyme. Based on the x-ray crystal structure of the related chalcone synthase from Medicago sativa a homology model was derived to draw conclusions on the altered reaction mechanism in the catalytic centre of the mutant relative to the wild- type. An additional binding pocket is identified in the catalytic centre of the mutant T135L. It binds the intermediate triketide with high affinity and prevents further elongation steps. The subsequent characterization of the kinetic parameters proves that wild-type and mutant T135L to have similar catalytic efficiency and illustrates the ability of turning a benzophenone synthase into a phenylpyrone synthase by a single point mutation.