Herstellung und Evaluierung eines Modellsystems zur in vivo Untersuchung der humanen DNA Fehlpaarungsreparatur (mismatch repair - MMR)
Die Fehlpaarungsreparatur (mismatch repair - MMR) ist der einzige DNA Reparaturweg, der auf die Korrektur von Replikationsfehlern spezialisiert ist. Darüber hinaus ist die MMR an der Antwort auf diverse DNA Schäden beteiligt, insbesondere an der Induktion von Zellzyklus¬arrest und Apoptose. Die Erkennung von während der Replikation oder der Reparatursynthese entstehenden DNA Fehlern erfolgt über die Heterodimere MutSalpha und MutSbeta, die von den Proteinen MSH2 und MSH6 bzw. MSH2 und MSH3 gebildet werden. Um die MSH Proteine in vivo untersuchen zu können, wurden die entsprechenden cDNAs in bi- und tricistronische Vektoren kloniert. Deren stabile Transfektion in die zwei humanen Zelllinien 293 und HT-1080 vermittelt die Expression der mit spezifischen Fluorochromen fusionierten MSH Proteine. Durch den Nachweis der Bindung endogener Partner und der Beteiligung an der Zellantwort auf UVA induzierte DNA Schäden wurde die Funktionalität der rekombinanten Wildtypproteine gezeigt. Sie akkumulieren alle zusammen mit PCNA am Ort der induzierten DNA Schäden nach UVA Bestrahlung. Dabei erreicht ihre Akkumulation wie die von PCNA ihr Maximum nach 5 Minuten. In dieser Arbeit wurden die Transkriptvarianten MSH2-V1, MSH3-V3, MSH3-V4, MSH3-V5 und MSH6-V3 nachgewiesen, von denen alle bis auf MSH2-V1 erstmals beschrieben werden. Unter den entsprechenden Proteinvarianten weist MSH2-V1 besondere Eigenschaften auf, da sie als einzige vom Zellkern ausgeschlossen ist. Nur die Proteinvariante MSH6-V3 ist zur Heterodimerbildung befähigt, akkumuliert aber ebenso wenig an UVA induzierten DNA Schäden wie die übrigen Proteinvarianten. Die Wildtypproteine MSH2, MSH3 und MSH6 sind am stärksten in der S-Phase exprimiert. Das Modellsystem zur Durchführung von in vivo Untersuchungen an den humanen MMR Komponenten MSH2, MSH3 und MSH6 wurde erfolgreich etabliert und steht weiteren Studien zur MMR Aktivität im Zusammenhang mit verschiedenen Mutagenen zur Verfügung.
Mismatch repair (MMR) is the only DNA repair pathway specialized in the correction of replication errors. Apart from that MMR is involved in the response to DNA damage, especially in the induction of cell cycle arrest and apoptosis. The recognition of errors arising during replication or repair synthesis is realized by the heterodimers MutSalpha and MutSbeta, formed by the proteins MSH2 and MSH6 or MSH2 and MSH3, respectively. To perform in vivo examination of the MSH proteins the respective cDNAs were brought into bi- and tricistronic vectors. Their transfection into the human cell lines 293 and HT-1080 mediated the expression of MSH proteins fused to specific fluorochromes. The functionality of the recombinant wildtype proteins was shown by the proof of their binding to endogenous partners and their involvement in the cell response to UVA induced DNA damages. Together with PCNA they accumulate at sites of induced DNA damages after UVA irradiation. The maximum accumulation of recombinant MSH wildtype proteins and PCNA is reached simultaneously 5 minutes after UVA treatment. During this work the alternatively spliced transcripts MSH2-V1, MSH3-V3, MSH3-V4, MSH3-V5 and MSH6-V3 were detected. Except for MSH2-V1 these are novel findings. Among the respective protein variants MSH2-V1 differs from the remaining by being excluded from the nucleus. MSH6-V3 is the only protein variant being able to form heterodimers. In contrast to the wildtype proteins none of the protein variants accumulates at sites of UVA induced DNA damages. Highest concentrations of the wildtype proteins MSH2, MSH3 and MSH6 were detected during S-phase. The model system for in vivo examination of the human MMR components MSH2, MSH3 and MSH6 was established successfully. It can be used for further studies of MMR activity after treatment with different mutagens.
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