Identifizierung und Charakterisierung der NH2-terminalen Domäne der Molybdäncofaktor-Sulfurase ABA3 aus Arabidopsis thaliana als Pyridoxalphosphat-abhängige L-Cystein-Desulfurase
Der Molybdäncofaktor (Moco) als Bestandteil so genannter Mo-Enzyme ist essentiell für eine Vielzahl an Stoffwechsel-Prozessen in nahezu allen bislang bekannten Organismen. Einige dieser Enzyme erhalten ihre biologische Funktion erst nach der enzymatisch katalysierten Sulfurierung des Moco. Hier wurde die cytosolische Moco-Sulfurase ABA3 aus Arabidopsis thaliana detailliert biochemisch analysiert. Grundlage dieser Untersuchung waren Homologien der NH2-terminalen Domäne von ABA3 (ABA3-NifS) mit NifS-Proteinen, für welche eine Funktion als L-Cystein-Desulfurasen bei der Synthese von Eisen-Schwefel-Clustern bekannt war. ABA3-NifS ist mit einer zweiten Domäne (ABA3-CT) fusioniert, die in vivo für die Moco-Sulfurierung essentiell ist. Es konnte gezeigt werden, dass ABA3-NifS über einen konservierten Lysin-Rest einen Pyridoxalphosphat (PLP)-Cofaktor koordiniert, der an der Formierung eines Persulfids beteiligt ist, welches an einem konservierten Cystein-Rest gebunden vorliegt. ABA3-NifS kann in vitro die Funktion von NifS-Proteinen bei der Synthese von Eisen-Schwefel-Clustern übernehmen und verfügt über die für NifS-Proteine typische Selenocystein-Lyase-Aktivität. Zudem ist ABA3-NifS in vitro in der Abwesenheit von ABA3-CT in der Lage, das Ziel-Enzym Aldehydoxidase zu sulfurieren. Interaktionsstudien beider ABA3-Domänen zeigen schwache aber signifikante Wechselwirkungen in vitro. Zudem konnte die Übertragung des Persulfids von ABA3-NifS auf ABA3-CT, wo es weiterhin als Persulfid nachweisbar ist, belegt werden. Diese Daten lassen sich in einem Modell zusammenfassen, welches für ABA3-NifS die Funktion als katalytische Domäne und für ABA3-CT eine Funktion bei der Übertragung des Persulfids vorschlägt. Die Entwicklung eines neuen In-Gel-Aktivitätsassays erlaubte erstmals die Visualisierung des nativen ABA3-Proteins anhand seiner Aktivität in pflanzlichen Rohextrakten. Parallel wurde die Moco-Sulfurase des Menschen (HMCS) einer ersten biochemischen Untersuchung unterzogen.
The Molybdenum Cofactor (Moco) as a part of the so called Mo-enzymes is essential for a multitude of metabolic processes in almost all yet known organisms. Some of these enzymes gain their activity not before the additional, enzymatically catalysed sulfuration of the Moco. In this work the cytosolic Moco sulfurase ABA3 from Arabidopsis thaliana was biochemically analysed in detail. The background of this analysis were homologies between the NH2-terminal domain of ABA3 (ABA3-NifS) and NifS-proteins, which function as L-cysteine desulfurases during iron sulfur cluster synthesis. ABA3-NifS is fused to a second domain (ABA3-CT), which is known to be essential for Moco sulfuration in vivo. It was shown that ABA3-NifS binds a pyridoxal phosphate (PLP) cofactor via a conserved lysine residue and that this cofactor is essential for the formation of a persulfide. In addition a conserved cysteine residue is required for persulfide binding. ABA3-NifS can fulfil the function of NifS-proteins during iron sulfur cluster synthesis in vitro and features a selenocysteine lyase activity which is typical for NifS proteins. In addition, ABA3-NifS is able to sulfurate the target enzyme aldehyde oxidase in vitro in the absence of ABA3-CT. Interaction studies of both domains in vitro reveal weak but significant interactions. Furthermore, an in vitro transfer of the persulfide from ABA3-NifS to ABA3-CT, where it was still detectable as a persulfide, was shown. These data suggest a model, which proposes the function of the catalytically active domain for ABA3-NifS, whereas ABA3-CT is involved in the transfer of the persulfide to the target enzymes.
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