Characterization of different types of radiation- and pressure-induced DNA damage in Bacillus subtilis spores and their global transcriptional response during spore germination
The extremely high resistance of bacterial endospores to environmental stress factors has intrigued researchers since long time and many characteristic spore features, especially those involved in the protection of spore DNA, have already been uncovered. The disclosure of the complete genomic sequence of B. subtilis 168 and the rapid development of transcriptional microarray techniques have opened new opportunities of gaining further insights in the enigma of spore resistance. It is the aim of this thesis to further elucidate the mechanisms of bacterial endospores resistance by applying those advanced biochemical, genetic and molecular biology techniques. Emphasis has been laid on reaching a better understanding of the DNA protection and repair strategies, which allow B. subtilis spores to cope with DNA damage induced by external stress factors. The following physical stress factors of environmental importance - either on Earth or in space - were selected for this thesis: (i) mono- and polychromatic UV radiation, (ii) ionizing radiation, (iii) exposure to ultrahigh vacuum; and (iv) high shock pressures simulating meteorite impacts. To reach a most comprehensive understanding of spore resistance to those harsh terrestrial or simulated extraterrestrial conditions, a standardized experimental protocol of the preparation and analyzing methods was established including the determination of the following spore responses: (i) survival, (ii) induced mutations, (iii) DNA damage, (iv) role of different repair pathways by use of a set of repair deficient mutants, and (v) transcriptional responses during spore germination by use of genome-wide transcriptome analyses and confirmation by RT-PCR. From this comprehensive set of data on spore resistance to a variety of environmental stress parameters a model of a “built-in” transcriptional program of bacterial spores in response to DNA damaging treatments to ensure DNA restoration during germination has been developed.
Die hohe Resistenz von Bakteriensporen gegenüber extremen Umweltfaktoren faszinierte Wissenschaftler seit langer Zeit. Eine Vielzahl von charakteristischen Merkmalen, insbesondere derjenigen, die in den Schutz der Sporen DNA eine entscheidende Rolle spielen, wurden bereits entdeckt. Die vollständige Sequenzierung des Genomes von B. subtilis 168 und die rasante Entwicklung der DNA microarray-Technologie eröffnet neue Möglichkeiten weitere Einblicke in die Rätsel der Widerstandfähigkeit der Sporen zu gewinnen. Ziel dieser Arbeit ist es, eine detailliere Aufklärung der Sporenresistenz durch die Anwendung von biochemischen, genetischen und molekularbiologischen Techniken zu erhalten. Der Schwerpunkt wurde auf DNA-Reparatur und Schutz-Strategien gelegt, die es erlauben Sporen, durch externe Stressfaktoren erzeugte, DNA Schäden zu reparieren bzw. zu verhindern. Die folgenden Umweltstressfaktoren wurden ausgewählt: (i) UV-Strahlung, (ii) ionisierende Strahlung, (iii) Exposition in Ultrahochvakuum, und (iv) extreme Stosswellendrücke, die einen Meteoritenauswurf simulieren. Um ein umfassendes Verständnis der Widerstandsfähigkeit gegenüber terrestrischen bzw. simulierten extraterrestrischen Bedingungen zu erzielen, wurde eine Reihe von standardisierten Protokollen für die Vorbereitung und Auswertung aller Experimente verwendet: (i) Überleben mittels Koloniebildungstest, (ii) induzierte Mutationen mittels partieller DNA Sequenzanalyse, (iii) Bestimmung von induzierten DNA-Schäden sowie deren möglichen Reparatur, (iv) Bedeutung von verschiedenen DNA Reparaturmechanismen durch den Einsatz von Reparatur-defizienten Mutanten, und (v) Bestimmung der transkriptionelle Antworten während der Sporenkeimung mittels Transkriptomanalysen. Aus diesen umfassenden Satz von Daten wurde ein Modell eines “eingebauten“ Transkriptionsprogrammes von bakteriellen Sporen als Reaktion auf DNA-schädigenden Behandlungen entwickelt, dass die DNA-Restaurierung während der Keimung gewährleistet.
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