Structure and function of virulence associated proteins from Pseudomonas aeruginosa and Yersinia enterocolitica
Previous to this work, the proteins PA0740 and PA5349 of Pseudomonas aeruginosa were found to affect the quorum sensing circuits of the bacterium. PA0740, annotated as ôhypothetical enzymeö or ôprobable beta-lactamaseö was found to have an attenuating effect on quorum sensing and was correspondingly believed to be a quorum-quenching enzyme. As part of this work, PA0740 was instead identified as a secreted SDS (sodium dodecylsulfate) hydrolase, allowing P. aeruginosa to use primary sulfate esters such as SDS as a sole source of carbon or sulfur. Furthermore, the crystal structure of the enzyme was solved, leading to a proposed mechanism which was corroborated by biochemical assays and mutagenesis studies. In contrast to the quorum quenching effect of PA0740, PA5349 was found to have a quorum sensing amplifying effect. PA5349 is a rubredoxin-reductase and has been implicated in degradation of n-alkanes by P. aeruginosa. The structures of PA5349 both alone and in complex with rubredoxin (PA5350), have not been described before and were solved at 2.40 and 2.45 ┼ resolution, respectively. The precise structural information which is now available for this redox couple will be useful for a deeper understanding of the underlying electron transfer processes. The second part of this work deals with heterologous expression and purification of the type-III secretion effector YopO of Yersinia enterocolitica. The described procedures present a major step towards the solution of the crystal structure of this important virulence determinant of Yersinia species.
Vor Beginn dieser Arbeit wurden die Proteine PA0740 und PA5349 aus Pseudomonas aeruginosa aufgrund ihres Einflusses auf das quorum sensing System des Bakteriums identifiziert. Das als „hypothetisches Enzym“ oder „wahrscheinliche beta-Lactamase” annotierte PA0740 zeigte einen attenuierenden Effekt auf das quorum sensing. Dieser Befund führte zu der Vermutung das es sich bei PA0740 ein quorum-quenching Enzym handelt. Diese Annahme wurde als Teil dieser Arbeit wiederlegt und PA0740 stattdessen als eine sekretierte SDS (Natrium Dodecylsulfat) hydrolysierende Alkylsulfatase identifiziert. Es wird gezeigt, das P. aeruginosa mit Hilfe von PA0740 ist in der Lage ist primäre Sulfatester als alleinige C- und S-Quelle zu verwerten. Auf der Basis der in dieser Arbeit gelösten Kristallstruktur von PA0740 wurde ein katalytischer Mechanismus vorgeschlagen, der mittels biochemischer Methoden und Mutagenesestudien verifiziert wurde. Im Gegensatz zum attenuierenden Effekt von PA0740 zeigte PA5349 einen verstärkenden Einfluss auf das quorum sensing. PA5349 ist eine Rubredoxin Reduktase und wurde bereits als Schlüsselfaktor beim Alkan-Abbau durch P. aeruginosa beschrieben. In dieser Arbeit wurden die Kristallstrukturen von PA5349 allein und im Komplex mit seinem physiologischen Bindungspartner Rubredoxin (PA5350) bei Auflösungen von 2.40 bzw. 2.45 Å gelöst. Die damit erstmals vorhandene präzise strukturelle Information für dieses Redox-Paar ist für das tiefere Verständnis von intermolekularen Elektronen-Transfer Reaktionen von großer Bedeutung. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden Methoden zur heterologen Expression und Reinigung des Typ-III Sekretionseffektors YopO aus Yersinia enterocolitica entwickelt. Die beschriebenen Methoden sind eine Voraussetzung für zukünftige Versuche die Kristallstruktur dieses wichtigen Virulenzfaktors zu bestimmen.
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