Structure and Function of Enzymes Involved in Tetrapyrrole Biosynthesis
This thesis approached four open questions regarding the pathway for the biosynthesis of heme and involved enzymes in bacteria, archaea and plants. 1. The novel antibiotic alaremycin was shown to inhibit porphobilinogen synthase from various bacterial, archaeal and eukaryotic sources. A co-crystal structure of alaremycin with Pseudomonas aeruginosa porphobilinogen synthase was obtained. Thus, the molecular basis of alaremycin function was solved at the atomic level. 2. Bioinformatic approaches failed to detect the uroporphyrinogen III synthase gene in plants. Our cooperation partner Alison Smith at Cambridge University, UK, had genetically isolated a potential open reading frame from Arabidopsis thaliana. In this thesis the corresponding protein was recombinantly produced and uroporphyrinogen III synthase activity was demonstrated, providing final proof for the identity of the gene. 3. The recently solved crystal structure of tobacco protoporphyrinogen IX oxidase was used as basis for the functional definition of the corresponding substrate binding site. Furthermore, the structural constellation causing the human disease variegate porphyria was functionally explored. For this purpose 14 enzyme variants were generated, produced, purified and tested for their kinetics and FAD contents. A detailed picture of the various chemical reactions occurring during substrate-enzyme interactions was obtained. The chemical basis for the enzymatic defect responsible for variegate porphyria was elucidated. 4. An alternative pathway for the biosynthesis of hemes in archaea was discovered and initially characterized. It was shown that in the archaeon Methanosarcina barkeri heme is synthesized via precorrin-2. Therefore, the last four to five steps of archaeal heme biosynthesis are completely different to their bacterial and eukaryotic counterparts.
In Rahmen dieser Arbeit wurden bislang ungeklärte Aspekte der Hämbiosynthese und beteiligter Enzyme in Archaea, Bakterien und Pflanzen bearbeitet. 1. Das kürzlich beschriebene Antibiotikum Alaremycin inhibiert Porphobilinogen Synthasen aus Archaea, Bakterien und Eukaryoten. Mittels Kokristallisation von Alaremycin in Komplex mit der Porphobilinogen Synthase aus Pseudomonas aeruginosa konnte der molekulare Mechanismus der Alaremycinwirkung auf atomarer Ebene aufgeklärt werden. 2. Bislang war die Identifizierung von Uroporphyrinogen III Synthasen aus Pflanzen mittels bioinformatischer Methoden nicht erfolgreich. In Kooperation mit Alison Smith, Cambridge Universität, UK, konnte einem Offenen Leseraster aus Arabidopsis thaliana diese Funktion mittels funktioneller Komplementation zugeordnet werden. In dieser Arbeit wurde das entsprechende Protein rekombinant produziert und die Enzymaktivität nachgewiesen. Somit konnte die Identität des Gens zweifelsfrei bewiesen werden. 3. Als Grundlage für die funktionale Definition der Substratbindedomäne der Protoporphyrinogen IX Oxidase diente die Kristallstrukur des mitochondrialen Enzyms aus Tabak. Des Weiteren wurde die strukturelle Grundlage der humanen Krankheit Porphyria Variegata am Tabakmodell untersucht. Zu diesem Zweck wurden 14 Enzymvarianten generiert, produziert, gereinigt und enzymkinetisch charakterisiert. Es konnte ein detaillierter Endruck von den chemischen Reaktionen bei der Substrat-Enzym Interaktion gewonnen werden. Die strukturelle und chemische Grundlage einer prominenten Konstellation der Porphyria Variegata konnte aufgeklärt werden. 4. Ein alternativer Syntheseweg für Häm in Archaea konnte im Rahmen dieser Arbeit erstmals aufgezeigt werden. Im Archaeon Methanosarcina barkeri erfolgte die Synthese von Häm über Precorrin-2. Die zweite Hälfte der Hämbiosynthese weicht daher grundsätzlich von den bakteriellen und eukaryotischen Synthesewegen ab.
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