Untersuchung der Genexpression in Aspergillus niger mittels Echtzeit-PCR

Inhalt: Der Pilz Aspergillus niger wird zur biotechnologischen Herstellung von homologen und heterologen Proteinen eingesetzt und gewinnt als Produzent von rekombinanten Proteinen immer mehr an Bedeutung. Die Kontrolle und Beurteilung solcher biotechnologischen Prozesse erfolgt derzeit ausschließlich über die Menge an gebildetem Protein. Die Kontrolle und Beurteilung dieser Produktionsprozesse erfordern allerdings eine ganzheitliche Betrachtung der Produktbildung. Hier wird eine Methode vorgestellt, mit welcher die Produktbildung bei A. niger bereits auf genetischer Ebene anhand der Menge der für das Zielprotein kodierenden mRNA beurteilt werden kann. Die Menge dieser produktspezifischen mRNA ist dabei ein Maß für die Genaktivität der Pilzzellen für ein bestimmtes Protein. Diese auf der Echtzeit-PCR basierende Methode zur Quantifizierung von mRNA setzt sich aus mehreren Schritten zusammen, die hier ausführlich beschrieben werden. Um die Genauigkeit der Quantifizierung einschätzen zu können, wurden die Schritte der Probenaufbereitung hinsichtlich ihrer Reproduzierbarkeit überprüft und festgestellt, dass viele variierende Faktoren eine genaue und reproduzierbare quantitative Analyse der mRNA beeinflussen können. Um dennoch mRNA reproduzierbar quantifizieren zu können, wurde ein Bezugssystem etabliert, welches die gleichen Probenaufbereitungsschritte inklusive Probenentnahme durchläuft wie die zu quantifizierende mRNA und somit alle variierenden Faktoren ausgleicht. Anhand der Produktion von Glucoamylase wurden erste quantitative Untersuchungen der produktspezifischen mRNA durchgeführt und die Bildung dieses Enzyms auf genetischer Ebene über der Kultivierung von A. niger AB 1.13 dargestellt. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass ein direkter Zusammenhang zwischen der Glucoamylasebildung und der Menge an glaA-mRNA besteht.