DNA-Microarrays zur Detektion von relevanten Antibiotikaresistenzen in Bacillus anthracis und Yersinia pestis

Die Medikation von Personen nach Exposition oder zur Prophylaxe gegen hochpathogene Bakterien muss schnellstmöglich und effektiv erfolgen, wobei gemäß Empfehlungen Erreger-spezifische Antibiotika verabreicht werden. Bei B. anthracis sind dies Ciprofloxacin, Doxycyclin, Rifampin und Vancomycin; bei Yersinia pestis Ciprofloxacin, Tetracyclin, Streptomycin und Gentamicin. Da die Behandlung der infizierten Personen in der Regel im klinischen Alltag ohne vorherige Überprüfung der Resistenzeigenschaft des Erregers geschieht, wurde eine auf Microarray-Technology basierende Schnelldiagnostik entwickelt, die es ermöglicht innerhalb von 4 - 7 Stunden eine zuverlässige Aussage über vorhandene relevante genetische Resistenzdeterminanten zu treffen. Zu diesem Zweck wurden jeweils für Bacillus anthracis und Yersinia pestis ein Versuchsablauf entwickelt, der zunächst einen DNA-Anreicherungsschritt enthält, der mit einer auf den Erreger abgestimmten Multiplex-PCR realisiert wurde. Im weiteren Verlauf wird eine multiplexe enzymatisch-fluoreszente Markierungsreaktion angeschlossen und das erhaltene Produkt auf den entwickelten Microarrays hybridisiert. Mit diesen ist es nun möglich, sowohl klinisch relevante Resistenzgene nachzuweisen (tet(A-D); tet(K-O); vanA; vanB; aac3-Ia, -IIa, -IVa; ant3-Ia, -IIa; aph6’’-Id; aph3’’-Ib), als auch Resistent-vermittelnde Mutationen in den Genen gyrA, gyrB, parC bzw. rpoB. Die Evaluation der Microarrays wurde aus politischen und ethischen Gründen nicht mit resistenten B. anthracis oder Y. pestis – Stämmen durchgeführt. Die Microarrays konnten jedoch aufgrund der sehr nahen Verwandtschaft der beiden Organismen zur B. cereus ATCC10987 bzw. Y. pseudotuberculosis DSM8992 mit resistenten Isolaten dieser Spezies evaluiert werden. Dabei wurde sowohl die Detektion der Resistenzgene mit Misch-DNA resistenter Spezies simuliert, als auch die Bestimmung Resistenz-vermittelnden Punktmutationen mit zuvor isolierten und charakterisierten Mutanten geprüft. Im weiteren Verlauf wurden Kinetik und Reproduzierbarkeit der entwickelten Versuchsabläufe untersucht sowie eine Blind-Studie mit klinischen Yersinia enterocolitica Isolaten durchgeführt.