Konditionale Mutagenese in der Maus: Generierung und Analyse konditionaler Mausmutanten

Fleige, Anne, Monika

doi:10.24355/dbbs.084-200701260100-0

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Konditionale Mutagenese in der Maus : Generierung und Analyse konditionaler Mausmutanten

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Zur einfachen und schnellen Generierung von konditionalen Mausmutanten wurde die Methode des ET Klonierens in unserem Labor etabliert und zur Erzeugung von Konstrukten zur konditionalen Inaktivierung des murinen IL12/IL23 p40 Gens und des Ifngr2 Gens eingesetzt. Beide Konstrukte wurden in ES-Zellen transfiziert und für das Ifngr2 Konstrukt konnten mehrere Klone mit homologer Rekombination des Konstrukts identifiziert werden. Von diesen ES Zellen wurden Chimäre erzeugt, die zur Rückkreuzung eingesetzt wurden. Die Kreuzung der konditionalen Mausmutante für das SRF Gen mit Mäusen, die die Cre Rekombinase unter dem B Zell spezifischen CD19 Promotor exprimieren, führt zur Generierung von Mäusen, die kein SRF in B Zellen exprimieren können. Erste Analysen zeigten, dass SRF zur Entwicklung und Funktion der meisten B Zellen nicht essentiell ist. Die basalen Antikörper Level sowie die Kalziummobilisierung in B Zellen zeigten keine Unterschiede bei Verlust des SRF Gens. Immunhistochemische Analysen der Milz zeigten, dass Mäuse in denen SRF in B Zellen inaktiviert ist, keine Marginal Zonen B Zellen bilden können. Auch ist die Anzahl an CD5+ B Zellen im Peritoneum verringert. Die konventionellen SRF defizienten B Zellen zeigen eine verringerte Oberflächenexpression von IgM, CD19 und CXCR4. Um Unterschiede in der Genexpression von SRF defizienten B Zellen zu identifizieren, wurden mRNA Arrays durchgeführt. Diese zeigten eine veränderte Expression in Genen der Zellproliferation (c-fos, junB), des Aktinzytoskellets (actin-g, actin-b, vinculin) und lymphozyten spezifischer Gene (CXCR4, ICAM-2, CD22, CD48).

To generate targeting constructs for the conditional mutagenesis in mice the new technique ET cloning was established in our lab. This method which bases on the enzyme mediated homologoues recombination in vivo in E. coli enables the mutagenesis of DNA at any desired point. This technique was used to generate targeting constructs for the conditional inactivation of the murine IL-12/ IL-23 p40 gene and the Ifngr2 gene. ES cells have been transfected with both constructs and for the Ifngr2 construct several ES cells clones with homologoues recombination have been identified. From these ES cells chimaera have been generated which are used for the back crossing. The crossing of the conditional SRF mouse mutant with mice expressing the cre recombinase under the control of the B cell- specific CD19 promotor leads to the generation of mice lacking SRF in B cells. These mice have been analysed to investigate the role of SRF in B cell development and function. First analysis show that SRF is not essential for the development and survival of B cells. The basal levels of Antibodies in the blood and the intracellular calcium levels are not impaired by the lack of SRF in B cells. Immunhistochemistry of the spleen reveals that mice lacing SRF in B cells show a complete loss of marginal zone B cells within the spleen indicating that this specific B cell population depends on the presence of SRF. In addition the number of peritoneal CD5+ B cells is reduced. In conventional SRF -/- B cells the expression of IgM, CD19 and CXCR4 are reduced. To identify differentially expressed genes mRNA arrays have been performed. These Arrays showed the impaired expression of several genes involved in cell proliferation (c-fos, junB), actin cytoskeleton (actin-g, actin-b, vinculin) and lymphocyte specific genes (CXCR4, ICAM-2, CD22, CD48).