Untersuchungen zur Eignung von Triplehelix-bildenden und bifunktionellen Oligonukleotiden als neue Werkzeuge zur in situ-Modifizierung von Pflanzengenen

Ziel der vorgestellten Arbeit war die Evaluierung von Triplehelix-bildenden und bifunktionellen Oligonukleotiden als neue Werkzeuge zur in situ-Modifizierung von Pflanzengenen. Aufbauend auf den im tierischen System entwickelten Grundlagen sollte die Übertragbarkeit dieser Methode auf das pflanzliche System untersucht werden. Für die Konstruktion eines Modellgens wurde ein Abschnitt aus dem Gen für die granule-bound starch synthaseI (gbssI) der Kartoffel verwendet. Dieser Abschnitt wurde mit dem Gen für das green fluorescent protein (gfp) fusioniert. Die gezielte Modifizierung eines zwischen den Gensequenzen gelegenen Stop-Codons in ein Sinn-Codon sollte die Aktivierung des ursprünglich inaktiven Modellgens bewirken. Es wurden verschiedene Varianten von Triplehelix-bildenden und bifunktionellen Oligonukleotiden erstellt. Mit Hilfe von in vitro-Versuchen konnte eine effiziente und sequenzspezifische Bindung von Oligonukleotiden an die Zielgensequenz nachgewiesen werden. Die Aufnahme verschiedener Oligonukleotide in Protoplasten nach einer Elektroporation und ihre Anreicherung im Zellkern wurden mit Hilfe der Konfocalen Laserscanningmikroskopie (CLSM) untersucht. Die rasche Anreicherung von fluoreszenzmarkierten Oligonukleotiden im Zellkern konnte gezeigt werden. In Protoplasten aus transgenen Kartoffelpflanzen wurden Versuche zur in situ-Aktivierung einer inaktiven Variante eines gfp-Modellgens durchgeführt. Aufgrund der geringen Effizienz der untersuchten Methode im transienten Modellsystem wurde ein selektierbares Modellgen-System auf der Basis des Bialaphos-Resistenzgens (bar) entwickelt. Aufgrund unvorhergesehener Schwierigkeiten in der Etablierung des Selektionssystems konnten die mit diesem System durchgeführten umfangreichen Modifizierungsversuche nicht ausgewertet werden. Eine Praxisrelevanz Triplehelix-bildender und bifunktioneller Oligonukleotide zur in situ-Modifizierung des gbssI-Gens besteht zur Zeit nicht.