Transgenic Plants as Tool to Study the Evolution of Pyrrolizidine Alkaloids

Abd Elhady, Mohamed, Ibrahim, Saleh, Mohamed

doi:10.24355/dbbs.084-200607130200-23

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Transgenic Plants as Tool to Study the Evolution of Pyrrolizidine Alkaloids

Abd Elhady, Mohamed Ibrahim Saleh Mohamed

English
German

In the present work a cDNA encoding deoxyhypusine synthase (DHS) of Tagetes (Asteraceae) has been identified by using a degenerate oligonucleotide primed PCR cloning strategy. Tissue culture of Senecio jacobaea has been successfully established. Callus, primordia and shoot regeneration of S. jacobaea have been achieved in MS media supplemented with 0.1-1.0 mg/l BAP and with 0.05-0.1 mg/l NAA. Furthermore, a protocol for the transformation of S. jacobaea has been established: The gusA gene under the control of CaMV 35S promoter has been introduced into the S. jacobaea plant using Agrobacterium tumefaciens. In another project a tobacco plant has been successfully transformed with cDNA encoding HSS of S. vernalis under the control of the CaMV 35S promoter. The resulting transgenic tobacco lines have been phytochemically analyzed in order to determine whether the “recruitment“ of homospermidine synthase (HSS) as the first specific enzyme of pyrrolizidine alkaloid biosynthesis is sufficient to explain the pathway evolution. Two transgenic lines were analyzed in comparison to the wild type using tracer technique analysis, HPLC and GC-MS. The results indicate that the transgenic tobacco lines produce large amounts of homospermidine that subsequently affect the polyamine pool within the plant Further analyzes have shown that genomic sequences do not influence the specificity of the hss promoter of S. vernalis after transformation into tobacco.

In der vorliegenden Arbeit wurde die cDNA der Desoxyhypusin-Synthase (DHS) von Tagetes (Asteraceae) mit degenerierten Primern identifiziert. Zudem konnte eine Gewebekultur von Senecio jacobaea erfolgreich etabliert werden. Die Bildung von Kallus und Primordien sowie die Sproßregeneration wurden in MS-Medium mit 0.1-1.0 mg/l BAP und 0.05-0.1 mg/l NAA erreicht. Außerdem wurde ein Protokoll für die Transformation von S. jacobaea etabliert. Ein gusA Gen, das sich unter der Kontrolle des CaMV 35S Promotors befand, wurde mit Hilfe von Agrobacterium tumefaciens erfolgreich eingeführt. In einem weiteren Projektabschnitt wurde eine Tabakpflanze mit der die Homospermidin-Synthase (HSS) aus S. vernalis codierenden cDNA unter Kontrolle des CaMV 35S Promotors transformiert. Die resultierenden transgenen Tabakpflanzen wurden phytochemisch analysiert, um festzustellen, ob die Expression der HSS als erstes spezifisches der Pyrrolizidinalkaloid–Biosynthese bereits ausreicht, um die Evolution des gesamtes Biosyntheseweges zu erklären. Zwei transgene Linien wurden im Vergleich zum Wildtyp mit Tracertechnik, HPLC und GC-MS Analyse untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass die transgenen Tabaklinien große Mengen an Homospermidin produzieren, Dadurch wird der gesamte Polyaminstoffwechsel der Pflanze beeinflußt. In weiteren Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass genomische Sequenzbereiche die Spezifität des hss Promotors aus S. vernalis nach Transformation in Tabak nicht beeinflussen.