Die Hämoxygenase BphO aus Pseudomonas aeruginosa
Hämoxygenasen (HO) katalysieren in Anwesenheit von Sauerstoff und geeigneten Elektronendonatoren die Umwandlung von Häm zu Biliverdin (BV), Fe2+ und CO. P. aeruginosa ist das erste beschriebene Bakterium, das zwei HOs mit unterschiedlichen Regiospezifitäten für die Hämspaltung besitzt. PigA spaltet Häm nur unter Eisenmangel an den ungewöhnlichen Positionen beta und delta, wobei BV IX-beta und IX-delta entstehen. BphO spaltet die alpha-meso-Kohlenstoffbrücke des Häms, so dass BV IX-alpha entsteht. BphO wurde rekombinant in E. coli produziert, mittels Affinitätschromatographie gereinigt und biochemisch charakterisiert. Die Entstehung von BV IX-alpha zeigte HPLC Analyse. Zusätzlich bestätigten vergleichende 1H- und 13C-NMR Studien der beiden HOs die Positionierung des Häms innerhalb von BphO, die eine Hydroxylierung der alpha-meso-Kohlenstoffbrücke zulässt. Verwendet man Ferredoxin als in vitro-Elektronendonator so verläuft die Reaktion bis zum Fe3+-BV. Durch Zugabe von Katalase läuft die Reaktion nur bis zum Oxy-Komplex ab, dies zeigt, dass der letzte Schritt über entstandene Hydroperoxidradikale verläuft. Nur durch Verwendung eines zweiten Reduktanden konnte der Oxy-Komplex zu BV umgewandelt werden. Nur in Anwesenheit zweier Reduktanden konnte Eisen-freies BV als Endprodukt beobachtet werden. BV hat hohe Affinität zur BphO, was schon während der Produktion und Reinigung durch eine grüne Farbe deutlich wurde. Aufgrund der Lokalisation von bphO in einem Operon zusammen mit bphP, das für ein apo-Phytochrom kodiert, wurde vermutet, dass BphO den Chromophor für den Photorezeptor BphP liefert. Es konnte bestätigt werden, dass BphO den Chromophor für BphP liefert und BphP das festgebundene BV aus BphO herauszieht und so die BphO Reaktion beschleunigt. Mit Hilfe von Gelpermeationschromatographie, Immunopräzipitation und Oberflächenplasmonresonanz-Spektroskopie konnten allerdings keine stabilen Komplexe zwischen BphO und BphP nachgewiesen werden, was auf eher transiente Natur der Interaktion zwischen beiden Proteinen hinweist.
Heme oxygenases (HOs) catalyze the oxidative cleavage of the heme to biliverdin (BV), iron and CO utilizing molecular oxygen and reducing equivalents. P. aeruginosa is the first bacterial contains two HOs with different regiospecificity of heme cleavage. PigA is only induced under iron limiting conditions and produces the unusual BV isomers BV IX-beta and IX-delta. The second HO of P. aeruginosa BphO cleaves the alpha-meso-carbon of heme regiospecifically with formation of BV IX-alpha. BphO was recombinantly produced in E. coli, affinity purified and biochemical characterised. The development of BV IX-alpha has been shown by HPLC analysis. Additional confirm the comparend 1H- and 13C-NMR studies of the both HOs the position of the heme in BphO indicate the hydroxylation on alpha-meso-carbon. Ferredoxin can serve as the in vitro electron donor in the BphO reaction, yielding Fe3+-BV as the final product. In the presence of catalase the conversion from heme to Fe3+-BV was arrested at the stage of the oxy-complex, suggesting that the conversion of the oxy-complex to Fe3+-BV is partly due by hydrogen peroxide, so is of the chemical nature. Only when a second reductant is added, is the oxy-complex oxidized to the final product. It has been shown that only in presence of two reductants Fe3+-free BV was the final product. BphO appears to have a high affinity toward BV, which is manifested as a green color during the production and purification. Because the bphO is located in an operon together with bphP, which encodes a bacterial apo-phytochrom, BphO is able to produce the chromophore for the potential photoreceptor BphP. It indicate that BphO produce the chromophore for BphP and BphP is able to pulled out the bound BV from BphO and accelerates the BphO reaction. The gel permeation chromatography, immunoprecipitation and surface plasmon resonance measurements has not been shown any stable complex between BphO and BphP, which suggest a transient interaction between this both proteins.
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