Struktur- und Funktionsanalyse von Pathogenitätsfaktoren aus Listeria monocytogenes und Staphylococcus aures

Eiting, Marina

doi:10.24355/dbbs.084-200603150100-19

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Struktur- und Funktionsanalyse von Pathogenitätsfaktoren aus Listeria monocytogenes und Staphylococcus aures

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Das Humanpathogen Listeria monocytogenes verursacht die seltene, jedoch lebensgefährliche Infektionskrankheit Listeriose. Eine große Anzahl der bekannten listeriellen Pathogenitätsfaktoren wird von einem einzigen Transkriptionsfaktor (PrfA) reguliert, der zur Crp/Fnr-Familie der bakteriellen Transkriptionsfaktoren gehört. Die Kristallstrukturen von PrfA und einer konstitutiv aktiven Mutante PrfAG145S konnten erfolgreich gelöst werden. Durch den strukturellen Vergleich konnte gezeigt werden, dass die Mutation G145S dramatische strukturelle Änderungen in PrfA auslöst, die insbesondere das HTH-Motiv betreffen. Das HTH-Motiv von PrfAG145S nimmt dabei überraschenderweise eine Konformation an, die dem des cAMP-induzierten, insbesondere dem des DNA-gebundenen Crp entspricht. Desweiteren konnte ein Tunnel in der PrfA-Struktur detektiert werden, der einen kleinen, teilweise hydrophoben Effektor als putativen Kofaktor binden könnte. Mittels Oberflächenplasmonresonanz-Spektroskopie wurden DNA-Bindungsaffinitäten für PrfA ermittelt. Zur detaillierten Analyse der Interaktion von PrfA mit DNA wurden Kokristallisationsversuche von PrfA mit unterschiedlichen Oligonukleotiden durchgeführt. Die ADP-Ribosylierung ist ein wichtiger Prozess, bei dem pathogene Organismen eukaryotische Proteine posttranslational modifizieren. Vor kurzem wurde in Staphylococcus aureus das Exoenzym C3stau2 entdeckt, das zur Familie der C3-ähnlichen ADP-Ribosyltransferasen gehört. Im Gegensatz zu C3bot1, dem Hauptrepräsentanten dieser Familie aus Clostridium botulinum, ADP-ribosyliert C3stau2 neben RhoA, -B und -C auch RhoE und Rnd3, die sich funktionell von den anderen GTPasen unterscheiden. Die Kristallstruktur von C3stau2 wurde erfolgreich gelöst. Dabei stellte sich heraus, dass C3stau2 strukturelle Ähnlichkeiten zu C3bot1 aufweist. Um die erweiterte Substratspezifität von C3stau2 im Detail untersuchen zu können, sollte der Komplex aus C3stau2 und RhoA kristallisiert und strukturell aufgeklärt werden.

The human pathogen Listeria monocytogenes causes listeriosis, a serious bacterial infection in humans. The majority of the known pathogenicity factors is regulated by a single transcription factor (PrfA), a member of the Crp/Fnr family of bacterial transcription factors. The crystal structures of PrfA and that of the constitutively active mutant PrfAG145S were solved successfully. The mutation is found to induce dramatic conformational changes especially as regards the helix-turn-helix (HTH) motif, required for DNA-binding. The HTH motif of PrfAG145S is surprisingly similar to that of Cap, the cAMP-activated catabolite gene activator protein, in its DNA-binding conformation. The structure of PrfA, furthermore, reveals a distinct tunnel sufficiently wide to accommodate a small, partly hydrophobe effector that could act as a putative cofactor of PrfA. Quantitative DNA-binding studies were done with surface plasmon resonance spectroscopy. To investigate PrfA-DNA-interaction in detail, cocrystallization experiments with different oligonucleotides were done. ADP-ribosylation is an important posttranslational modification of eukaryotic proteins in pathogenic mechanisms. Recently, in Staphylococcus aureus the exoenzyme C3stau2 was identified, a member of the C3-like ADP-ribosyltranferases (ADP-RT). In contrast to C3bot1, the prototype of the C3-like ADP-RT, C3stau2 modifies in addition to RhoA, -B and -C the GTPases RhoE and Rnd3 that functionally differ from other GTPases. Here we present the crystal structure of C3stau2. As expected the structure of C3stau2 shows strong structural similarity with that of C3bot. To investigate the additional substrate specificity of C3stau2 in detail, crystallization of the complex of C3stau2 and RhoA was done.