Analysen zur Identifizierung einer spezifischen Sulfurtransferase für die Molybdäncofaktor Biosynthese in Escherichia coli

Der Molybdäncofaktor (Moco) ist mit seiner universellen Funktion ein essentieller Bestandteil aller Molybdoenzyme, mit Ausnahme der Nitrogenase. Im zweiten Schritt der Molybdäncofaktor Biosynthese findet die Umwandlung von Precursor Z zu Molybdopterin statt. Die E. coli MPT-Synthase ist ein Heterotetramer aus zwei kleinen (MoaD) und zwei großen (MoaE) Untereinheiten. Um katalytisch aktiv zu sein, muss MoaD in thiocarboxylierter Form vorliegen. Die Identifizierung des dafür verantwortlichen schwefel-übertragenden Proteins stand im Mittelpunkt dieser Arbeit. Die Untersuchungen zeigten, dass weder eine der L-Cystein Desulfurasen IscS, CSD oder CsdB, noch eine der bislang acht bekannten Rhodanese-ähnlichen Proteine essentiell für die Thiocarboxylierung von MoaD in E. coli beteiligt ist. Allerdings konnte mit Hilfe der Tandem-Affinity-Purification (TAP)-Methode in E. coli eine in vivo Interaktion zwischen MoeB und dem Rhodanese-ähnlichen Protein YnjE identifiziert werden. Dass es sich dabei um eine spezifische Interaktion handelt, konnte durch biochemische Untersuchungen mit gereinigtem YnjE bestätigt werden. Neben YnjE ist auch die E. coli Einzeldomänen-Rhodanese YgaP näher charakterisiert worden. Durch die im Hefe Two-Hybrid identifizierte in vivo Interaktion von YnjE und der E. coli Sulfurtransferase IscS wurde gezeigt, dass eine Persulfurierung von YnjE in vitro durch IscS mit L-Cystein als Schwefelquelle erfolgen könnte. Mit IscS als Schwefeldonor konnte YnjE in vitro den Schwefel auf MoaD übertragen und die MPT- Synthase aktivieren. Diese Ausbildung der Persulfidbindung ist massenspektrometrisch bestätigt worden.