Entwicklung eines transkriptionell regulierten Systems zur konditionalen Immortalisierung

Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines transkriptionell regulierten Systems zur konditionalen Immortalisierung. Hierfür wurde der autoregulierte Vektor pRITA generiert, der auf einem bidirektionalen tet-abhängigen Promoter basiert. Dieser treibt sowohl die Expression des Simian Virus 40 Large T Antigen (TAg) als auch die des reversen Transaktivators. Mit Hilfe von pRITA konnten embryonale Mausfibroblasten immortalisiert werden, die im aktivierten Zustand immortalisiert, im reprimierten Zustand seneszent sind. Verglichen mit dem tsTAg - die Standardmethode zur konditionalen Immortalisierung - ermöglicht pRITA eine stringentere Proliferationskontrolle mit geringeren Einfluss auf die Zellphysiologie. Eine Genexpressionsanalyse von aktivierten und reprimierten pRITA-Zellen zeigte grundlegende Unterschiede beider Zustände auf, wobei die beobachteten zellulären Phänotypen molekular beschrieben werden konnten. Weiter zeigte sich, dass pRITA definiert in das Transkriptom eingreift, da bei wiederholter Induktion identische Veränderungen im Expressionsmuster der Zelle hervorgerufen wurden. Darüber hinaus wurde mit der "DNA-Chip"-Analyse demonstriert, dass die reprimierten pRITA-Zellen nicht primären Zellen ähneln. Somit ermöglicht pRITA die Inaktivierung des immortalisierenden Gens und dessen Effekten, aber die Onkogeninaktivierung führt nicht dazu, dass die Zellen in den ursprünglichen primären Zustand gelangen.