Untersuchungen zur Struktur und Funktion der Plasminogen-bindenden alpha-Enolase aus Streptococcus pneumoniae und der Tubulin-Tyrosin Ligase aus Sus scrofa

1. Die a-Enolase aus Streptococcus pneumoniae Das humanpathogene Bakterium Streptococcus pneumoniae interagiert im Infektionsprozess mit Komponenten des Serums und der extrazellulären Matrix. Die a-Enolase, innerhalb der Bakterienzelle ein Glykolyseenzym, bindet darüber hinaus als Oberflächenprotein der Pneumokokken an das humane Zymogen Plasminogen, wodurch die Migration des Bakteriums in tiefere Gewebeschichten des Wirtes eingeleitet wird. Die a-Enolase wurde heterolog in E.coli produziert, gereinigt und kristallisiert. Die Struktur des Enzyms wurde durch Molekularen Ersatz gelöst. Bei einer Auflösung von 2.0 Å wurde erstmals die Struktur einer Plasminogen-bindenden und zudem oktameren Enolase beschrieben. Weitrhin wurden die auf Aminosäureebene bekannten Plasminogen-Bindungsstellen lokalisiert. Bindungsstudien zur Interaktion der a-Enolase mit den verschiedenen Plasminogenteilfragmenten Kringle 1-3, 1-4 und 1-5 zeigten, dass das Teilfragment Kringle1-5 des humanen Plasminogens die höchste Affinität für die a-Enolase besitzt. 2. Die Tubulin-Tyrosin Ligase aus Sus scrofa Die Tubulin-Tyrosin Ligase ist eine Peptidligase, die in tRNA-unabhängiger Weise ein Tyrosin an den C-Terminus von alpha-Tubulin anfügt. Das Enzym bildet dabei einen Komplex mit dem löslichen alpha/beta-Tubulin. Durch den Austausch der Cysteine 71, 91, 238, 244, 294 und 347 gegen Serin konnten erstmals Kristalle mit einem Beugungsvermögen von 3.3 Å erzeugt werden. Kristalldefekte erlaubten es jedoch nicht, diese für die Röntgenstrukturanalyse zu verwenden. Aktivitätsuntersuchungen der multiplen Cystein-Mutanten zeigten, dass Austausche von Cystein 294 und 338 die Aktivität des Enzyms herabsetzen und diese daher möglicherweise in der Nähe des aktiven Zentrums liegen. Die TTL ist ein proteaseempfindliches Enzym mit einer geringen Löslichkeit. Komplexierungsstudien der TTL mit Fab-Fragmenten des monoklonalen Anti-körpers ID3 zeigten, dass mit dieser Methode die Löslichkeit des Enzyms wesentlich erhöht werden konnte. Der Antikörper bindet einen der proteaseempfindlichen Bereiche und eignet sich daher besonders zur Herstellung einer homogenen Proteinprobe für die Kristallisation. Zudem wurde im Rahmen der Arbeit mit der Isolierung und Kristallisation des Komplexes zwischen der TTL und alpha/beta-Tubulin als Basis für die Strukturaufklärung begonnen.