New bacterial pathway of 4- and 5-chlorosalicylate degradation via 4-chlorocatechol and maleylacetate in a Pseudomonas strain
In the present study a novel metabolic pathway for 4-and 5- chlorosalicylate degradation in Pseudomonas sp. strain MT1, a bacterial isolate derived from a four-membered 4-chlorosalicylate degrading community, was elucidated. 4-chlorocatechol, 3-chloromuconate and maleylacetate were identified to be metabolites of the pathway. Transformation of 4- and 5-chlorosalicylate was shown to be catalyzed by a salicylate 1- hydroxy-lase. The reaction product 4-chlorocatechol was subject to intradiol cleavage by a catechol 1,2-dioxygenase with substrate specificity similar to enzymes of the 3-oxoadipate pathway. Thus MT1 is the first strain described to mineralize chloroaromatics without the involvement of a dioxygenase specialized for chloroaromatic ring-cleavage. Transformation of 3-chloromuconate constitutes the core of the novel pathway and the responsible enzymes were identified and purified. Muconate cycloisomerase (MCI) catalyzed 3-chloromuconate transformation to mainly protoanemonin and minor amounts of cis dienelactone and maleylacetate. Protoanemonin and cis-dienelactone are dead-end products of MT1 metabolism. A second muconate cycloisomerase (MCIB), transforms 3-chloromuconate to protoanemonin and cis-dienelactone in equal amounts and is assumed to be an evolutionary intermediate between muconate and chloromuconate cycloisomerases. Even though purified trans dienelactone hydrolase (trans-DLH) acts neither on 3- chloromuconate, nor on protoanemonin, it was found that simultaneous presence of trans-DLH and one of the cycloisomerases yielded considerately less protoanemonin and more maleylacetate than when 3-chloromuconate was transformed by MCI or MCIB alone. As trans-DLH converts 4-fluoromuconolactone to maleylacetate, it is suggested that this enzyme hydrolizes 4-chloromuconolactone, the assumed intermediate of 3-chloromuconate cycloisomerization, and thus prevents protoanemonin formation in favor of maleylacetate formation. cis-Dienelactone formation was not effected by the presence of trans-DLH, indicating that its production does not necessitate the intermediate formation of 4-chloromuconolactone. Maleylacetate is channeled to the 3- oxoadipate pathway by a maleylacetate reductase (MAR). Detailed analysis of 3-chloromuconate transformation by the concomitant action of purified MCI (or MCIB) and trans-DLH revealed that product formation was not only dependent on the ratio of enzymes, but that higher protein concentrations favored maleylacetate formation over protoanemonin formation. Such a behavior can be explained by kinetic models describing the reaction mechanism with a spontaneous degradation of 4- chloromuconolactone to protoanemonin competing with a trans-DLH catalyzed hydrolization of 4-chloromuconolactone to maleylacetate. MCI was induced to high activity during growth on salicylate and to a much lower extent during growth on chlorosalicylate. This indicates that MCI, despite its extraordinary high activity with 3- chloromuconate is part of the 3-oxoadipate pathway of MT1. In contrast, MCIB and trans-DLH were predominantly induced during growth on chlorosalicylate. This suggests that MCI and MCIB belong to independent regulons. trans-DLH differs from previously described cis/trans-dienelactone hydrolases not only by substrate specificity, but also by its susceptibility to reducing and chelating agents. Partial protein sequences revealed no homology to previously described proteins. Thus, trans-DLH seems to be a member of a previously undescribed protein family.
In der vorliegenden Arbeit wurde ein neuer Abbauweg von 4- und 5 Chlorsalicylat in Pseudomonas sp. Stamm MT1, einem Bakteriumisolat stammend aus einer 4-Chlorsalicylat abbauenden 4 Arten Gemeinschaft, aufgeklärt. 4-Chlorcatechol, 3-Chloromuconat und Maleylacetat wurden als Metabolite des Abbauweges identifiziert. Eine Salicylat 1 Hydroxylase katalysiert die Umwandlung von 4- und 5 Chlorsalicylat. Das Produkt 4-Chlorcatechol wird in ortho-Position durch eine Catechol 1,2-Dioxygenase, die eine ähnliche Substratspezifität wie entsprechende Enzyme des 3-Oxoadipat Weges aufwies, gespalten. Daher ist MT1 der erste Stamm für den eine Minerlisation von Chloraromaten ohne Beteiligung einer für die Ringspaltung von chlorierten Aromaten spezialisierten Dioxygenase beschrieben wurde. Die Umwandlung von 3-Chlormuconat stellt das Kernstück des neuen Abbauweges dar. Die verantwortlichen Enzyme wurden identifiziert und gereinigt. Muconat Cycloisomerase (MCI) katalysiert eine 3 Chlormuconat-Umwandlung zu hauptsächlich Protoanemonin und geringen Mengen an cis-Dienlacton und Maleylacetat. Protoanemonin und cis-Dienlacton sind Dead-end Produkte des MT1 Metabolismus. Eine zweite Muconat Cycloisomerase (MCIB), wandelt 3-Chlormuconat zu Protoanemonin und cis-Dienelacton in gleichen Teilen um und wird als evolutionäres Intermediat zwischen Muconat und Chlomuconat Cycloisomerasen eingeschätzt. Die gereinigte trans-Dienlacton Hydrolase (trans-DLH) setzt weder 3- Chlormuconat, noch Protoanemonin um. Dennoch wurde beobachtet, dass die Cycloisomerasen (MCI oder MCIB) im Beisein von trans-DLH weniger Protoanemonin, aber mehr Maleylacetat aus 3-Chlormuconat bildeten, als die Cycloisomerasen alleine. Da trans-DLH 4 Fluormuconolacton zu Maleylacetat umwandelt, kann angenommen werden, dass das Enzym auch 4-Chlormuconolacton, das postulierte Intermediat der 3-Chlormuconat Cycloisomerisierung, zu Maleylacetat hydrolysieren kann und dass dadurch die Bildung von Protoanemonin verhindert wird. cis-Dienlacton-Bildung wird nicht durch das Beisein der trans-DLH beeinflußt. Dies weist darauf hin, dass die Bildung von cis Dienlacton nicht die intermediäre Bildung von 4-Chlormuconolacton benötigt. Maleylacetat wird durch einer Maleylacetat Reductase (MAR) über 3-Oxoadipat weiter verstoffwechselt. Detailierte Untersuchungen zur Umwandlung von 3-Chlomuconat durch gemeinsamen Umsatz durch MCI (oder MCIB) und trans-DLH zeigten, dass die Produktbildung nicht nur abhängig vom Enzymverhältnis ist, sondern dass auch eine höhere Proteinkonzentration die Bildung von Maleylacetat gegenüber Protoanemonin begünstigt. Diese Beobachtungen können mit kinetischen Modellen, deren Reaktionsmechanismus auf der Konkurrenz eines spontanen Zerfall von 4-Chlomuconolacton zu Protoanemonin mit einer durch die trans-DLH katalysierten Hydrolyse von 4-Chlormuconolacton zu Maleylacetat beruht, erklärt werden. MCI ist stark induziert während Wachstum mit Salicylat und schwach induziert während Wachstum mit Chlorsalicylat. Dies weist darauf hin, dass MCI, obgleich sie eine auáerordentlich hohe Aktivität mit 3-Chlormuconat aufweist, Teil des 3-Oxoadipat-Weges in MT1 ist. Dagegen sind MCIB und trans-DLH vorwiegend durch Wachstum mir Chlorsalicylat induziert, was darauf hindeutet, dass MCI und MCIB voneinander unabhängigen Regulons angehören. trans-DLH unterscheidet sich von bisher beschriebenen cis/trans Dienlacton Hydrolasen nicht nur, durch Substratspezifität, sondern auch durch ihre Empfindlichkeit gegenüber reduzierenden und chelatierenden Agenzien. Partielle Proteinsequenzierung ergab keine Homologien zu bisher beschriebenen Proteinen. Daher scheint trans-DLH ein Mitglied einer bislang unbeschriebenen Proteinfamilie zu sein.
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