Analyse der Interaktion des GRAB Proteins von S. pyogenes mit a2-Makroglobulin: Einfluss der Interaktion auf die Virulenz und Aufklärung der a2-M Bindungsepitope in GRAB

Godehardt, Antonia, W.

doi:10.24355/dbbs.084-200511080100-454

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Analyse der Interaktion des GRAB Proteins von S. pyogenes mit a2-Makroglobulin : Einfluss der Interaktion auf die Virulenz und Aufklärung der a2-M Bindungsepitope in GRAB

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Ziel dieser Arbeit war die Analyse der Interaktion von S. pyogenes mit dem menschlichen Proteaseinhibitor alpha2-Makroglobulin (a2M). Das a2M-bindende Protein GRAB von S. pyogenes vermittelt die Interaktion in 23% der klinischen Stämme, 80% davon aus Haut- und 20% aus Racheninfekten. Eine Analyse der Interaktion von GRAB mit a2M identifizierte zwei Bindungsmotive von GRAB. Als minimale Bindungsepitope wurden die As-Sequenzen PR42IIPNGGTL und NAPEKLALR64N identifiziert. Die essentielle Funktion von R42 und R64 für die GRAB-a2M-Interaktion wurde durch systematische Substitution der As nachgewiesen. Da Seren GAS infizierter Patienten anti-GRAB gerichtete Antikörper enthielten, wurde der Einfluss von GRAB auf den Infektionsprozess untersucht. In einem Hautinfektionsmodell mit C3H/HeN und BALB/c Mäusen wurde das a2M bindende S. pyogenes Isolat KTL3 mit einer isogenen grab-Mutante (MR4) verglichen. Subkutan mit MR4 infizierte Mäuse überlebten länger, entwickelten kleinere Läsionen und wiesen eine geringere Bakterienzellzahl in den Organen auf, was GRAB als Virulenzfaktor bestätigte. Immunisierungsstudien mit rGRAB verliefen negativ. Trotz positiver Immunantwort konnte die Überlebensrate nicht gesteigert werden. Eine Analyse der a2M Bindungsaktivität ergab, dass systemische Bakterien ihre Bindungsaktivität verloren hatten während aus der Haut isolierte Erreger mit a2M interagierten, was auf eine Regulation der grab Expression während der Infektion hindeutet.

Aim of this study was to analyse the interaction between S. pyogenes and the human plasma protease inhibitor alpha2-macroglobulin (a2M). The a2M binding protein GRAB of S. pyogenes is mediating the interaction in 23% of all clinical isolates tested, 80% from skin- and 20% from throat-infections. An analysis of the interaction between GRAB and a2M revealed two different binding motifs in GRAB. The aa-sequences PR42IIPNGGTL and NAPEKLALR64N were identified as minimum binding epitopes. The role of R42 and R64 as essential aa for the GRAB-a2M-interaction was determined by systematic mutational analysis. Hence sera of GAS infected convalescent patients contained anti-GRAB antibodies, the influence of GRAB on infection process was determined. In a murine model of GAS skin infection on BALB/c and C3H/HeN mice virulence of the a2M binding S. pyogenes wildtype strain KTL3 was compared with its isogenic grab-mutant (MR4). Mice subcutaneously infected with MR4 survived longer, developed smaller skin lesions and exhibited lower levels of bacterial dissemination denoting a contribution of protein GRAB as virulence factor. Vaccination of mice with rGRAB revealed a positive immune response but no protection against S. pyogenes. An analysis of a2M binding activity showed that bacteria isolated from systemic organs lost their binding ability whereas bacteria from the skin of infected mice were still able to bind a2M indicating that grab-expression is regulated during infection process.