Die Glutamyl-tRNA Reduktase aus Escherichia coli : Rekombinante Produktion, Enzymmechanismus und biochemische Charakterisierung

Tetrapyrrole sind essentielle Bestandteile biologischer Systeme. Escherichia coli Glutamyl-tRNA Reduktase katalysiert im Rahmen der Tetrapyrrolbiosynthese die NADPH-abhängige Reduktion eines tRNA-gebundenen Glutamats zu Glutamat-1-semialdehyd. In der vorliegenden Arbeit gelang es erstmals das Enzym rekombinant bis zur apparenten Homogenität darzustellen. Es wurde eine spezifische Aktivität von 0.47 µmol min-1 mg-1 mit E. coli Glu-tRNA(Glu) als Substrat für das dimere Enyzm bestimmt. Der postulierte Enzymmechanismus wurde durch den direkten experimentellen Nachweis des zentralen Thioester-Zwischenproduktes bewiesen. Durch Mutagenesestudien konnte der hoch konservierte Cystein-Rest 50 als Nukleophil des aktiven Zentrums identifiziert werden. Durch kinetische Analysen mit den GluTR-Varianten R52Q und R52K in Kombination mit dem artifiziellen Substrat Gln-tRNA(Glu) konnte die zentrale Rolle von Arginin 52 für die richtige Positionierung des Substrates und für die Differenzierung zwischen Glutamat und Glutamin nachgewiesen werden. Der Vergleich von Enzymkinetiken mit in vitro synthetisierter, unmodifizierter Glu-tRNA(Glu) und modifizierter Glu-tRNA(Glu) zeigten, dass die posttranskriptionalen Modifikationen der tRNA keinen Einfluß auf die Erkennung durch die GluTR haben. Durch Co-Immunopräzipitationsstudien konnten direkte Protein-Protein-Wechselwirkungen von E. coli GluRS, GluTR und GSA-AM nachgewiesen werden.