Nachweissysteme zur Genexpressionsanalytik von Bakterien

Zur Optimierung der Fermentation eines rekombinanten Proteins wurde seine messenger RNA (mRNA) quantifiziert und ihr Verhältnis zu anderen mRNAs der Zelle untersucht. Von besonderem Interesse waren mRNAs, die den physiologischen Zustand der Zelle (z.B. bei Stress) widerspiegeln. Als rekombinantes Modellprotein wurde der basische Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) gewählt, der mit Escherichia coli-Stämmen als pharmazeutisch relevantes Produkt hergestellt wird. Für die mRNA dieses Wachstumsfaktors wurden Nachweisstrategien mit verschiedenen optischen Sensoren, sowie mit Mikrotiterplattenassays entwickelt. Alle Methoden waren darauf ausgelegt, bFGF-mRNA in seiner nativen Form ohne Amplifikationsschritt nachweisen zu können. Dies erübrigt die Notwendigkeit von Markierungen oder von Polymerasekettenreaktionen zur Amplifikation. Mit DNA-Mikroarrays wurde die Expression von Genen untersucht, die in Zusammenhang mit der Produktion von bFGF, dessen Induktion oder anderen Fermentationsparametern stehen. Das BIACORE-Gerät als optischer Affinitätssensor erlaubte den Nachweis von ca. 15 µg/mL bFGF-mRNA (ca. 80 pmol/mL). Mit einem zur Detektion von bFGF-mRNA entwickelten kolorimetrischen Assay in der Mikrotiterplatte ließ sich eine untere Nachweisgrenze von ca. 5 ng/mL (27 fmol/mL) erreichen. Mit DNA-Chips wurden insbesondere die Expression von Genen betrachtet, die nach einem Hitzeschock oder nach Induktion des rekombinanten Proteins mit IPTG verstärkt oder vermindert exprimiert wurden. Es werden in der Arbeit zudem mögliche Fehlerquellen und die Reproduzierbarkeit von DNA-Mikroarray- Experimenten diskutiert.