Studies of the roles of the presynaptic proteins Munc13-1/RIM1, Snapin and CSP in neurotransmitter release using hippocampal autapses
The process of neurotransmitter release at the synapses of classical neurons is confined to the active zones. At the active zones steps of vesicle trafficking like tethering, priming to fusion competence, and Ca2+ triggered fusion are occurring in a highly coordinated pattern, with a cooperation of various specialized proteins with specific roles at specific times. Using the techniques of whole-cell voltage-clamp and SFV-mediated overexpression of a single presynaptic protein in the mouse hippocampal neurons grown in micro-island culture, the physiological roles of presynaptic proteins like Munc13-1/RIM1 in vesicle priming, Snapin, a SNARE associated PKA target, and CSP/SGT/Hsc-70, a trimeric chaperonic complex, a functional form of CSP, at presynapses have been shown. The interaction between active zone proteins Munc13-1 and RIM1 via RIM1 binding N-terminal region of Munc13-1, together with priming competent C-terminal region of Munc13-1 is important in creating a functional link between synaptic vesicle tethering and priming at the active zone. Synaptic vesicle docking and fusion are mediated by the assembly of a stable core complex consisting of synaptic vesicle protein synaptobrevin and plasma membrane proteins syntaxin and SNAP-25. cAMP-dependent, PKA-mediated, phosphorylated state of Snapin enhances its binding to SNAP-25, leading to biochemically observed increase in the interaction between putative Ca2+ sensor synaptotagmin and fusion machinery SNARE-complex. Snapin, in its phosphorylated state leads to a modulation of a neurotransmitter release through an increase in the average vesicular release probability. CSP/SGT/Hsc-70, a trimeric chaperonic complex, could be speculated as a functional form of CSP, important for proper presynaptic function.
Nervenzellen kommunizieren untereinander durch chemische Botenstoffe, den Neurotransmittern, welche in den Synapsen im Bereich der aktiven Zonen aus Vesikeln freigesetzt werden. Die regulierte Ausschüttung von Neurotransmittern aus den Vesikeln erfordert vom Transport der Vesikel zur aktiven Zone, der Anlagerung (tethering) an der präsynaptischen Membran und der Vorbereitung (priming) sowie calciumabhängigen Induzierung der Vesikelverschmelzung mit der präsynaptischen Membran das präzise zeitliche und räumliche Zusammenspiel einer Vielzahl unterschiedlicher Proteine. In dieser Arbeit wurde die physiologische Funktion der präsynaptischen Proteine Munc13-1/RIM1 beim Vesikelpriming, dem SNARE-assoziiertem PKA-Substrat Snapin sowie des trimeren CSP/SGT/Hsc-70 Chaperonkomplexes bei der Exozytose mit Hilfe elektrophysiologischer Messungen an autaptischen Mikroinselkulturen hippokampaler Neurone durch Kombination mit viraler Überexpression der entsprechenden Proteine untersucht. Die Interaktion von RIM1 mit dem N-Terminus von Munc13-1 ist eine entscheidende Verknüpfung zwischen tehtering und der c-terminalen Primingfunktion von Munc13-1 in der aktiven Zone. Die Anlagerung von synaptischen Vesikeln und deren Fusion mit der präsynaptischen Membran erfolgt unter Ausbildung eines stabilen Proteinkomplexes zwischen dem vesikelassoziierten Protein Synaptobrevin und den auf der präsynaptischen Membran lokalisierten Proteinen SNAP-25 und Syntaxin. Biochemisch wurde gezeigt, dass der über PKA c-AMP-abhängige Phosphorylierungszustand von Snapin über seine Bindung an SNAP-25 die Interaktion zwischen dem aus Synaptobrevin, SNAP-25 und Syntaxin bestehendem SNARE-Fusionskomplex mit dem putativem Calciumsensor Synaptotagmin reguliert. Phosphorylierung von Serin 50 in Snapin moduliert die Neurotransmitterausschüttung durch eine Erhöhung der durchschnittlichen Ausschüttungswahrscheinlichkeit der Vesikel.
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