Die sauerstoffabhängige Coproporphyrinogen III Oxidase (HemF) aus Escherichia coli : Rekombinante Herstellung, biochemische und biophysikalische Charakterisierung

Tetrapyrrole sind essentielle Bestandteile biologischer Systeme. Coproporphyrinogen III Oxidasen katalysieren im Rahmen der Tetrapyrrol-Biosynthese die Umsetzung von Coproporphyrinogen III zu Protoporphyrinogen IX. Diese Reaktion entspricht einer oxidativen Decarboxylierung zweier Propionatreste zu Vinylgruppen. Drei unterschiedliche Enzyme katalysieren die Reaktion ohne und mit Nutzung von Sauerstoff. Der Enzymmechanismus aller drei Oxidasen ist unbekannt. Das sauerstoffabhaengige Enzym (HemF) aus Escherichia coli wurde rekombinant produziert und mit einer neu entwickelten Methode affinitaetschromatographisch gereinigt. Es konnte ein schneller fluorimetrischer Aktivitaetsnachweis etabliert werden und die katalysierte Reaktion mittels HPLC bewiesen werden. Das als Dimer aktive HemF zeigte einen Km-Wert von 2.6 uM und einen kcat von 0.17 min-1 bei einem pH-Optimum von 6.0. Chelatisierungsreagenzien verringerten signifikant die enzymatische Aktivitaet von HemF. Als einziges Metall rekonstituierte Mangan die Enzymaktivitaet. Mangan konnte schliesslich im Enzym mittels UV/VIS-Spektroskopie, magnetischem Zirkulardichroismus (MCD) und Atomabsorptionsspektroskopie (AAS) nachgewiesen werden. Mutagenese-Studien identifizierten H96, H106, H145, H175 und W274 als bedeutsam fuer die Katalyse. Als Produkt der enzymatischen Reaktion konnte Peroxid identifiziert werden. Ueberaschend konnte eine anaerobe Enzymaktivitaet von HemF gezeigt werden. Es wurden Hinweise fuer eine radikalische Reaktion bei der Umsetzung des Coproporphyrinogen III gefunden. Bei ersten Kristallisationsexperimenten wurden kleine Proteinkristalle erhalten. Aus diesen Ergebnissen konnte ein hypothetischer Reaktionsmechanismus entwickelt werden.