Gezielte Entwicklung von Bacillus megaterium für biotechnologische Anwendungen

Martens, Jan, Henning

doi:10.24355/dbbs.084-200511080100-599

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Gezielte Entwicklung von Bacillus megaterium für biotechnologische Anwendungen

German
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Ziel dieser Doktorarbeit war die Etablierung eines gentechnisch optimierten Vitamin B12-Produktionsstammes auf Basis von Bacillus megaterium. Dafür wurde ein Minimalmedium definiert, dass aerobes und anaerobes Wachstum verschiedener Vitamin B12 produzierender B. megaterium Stämme ermöglicht. Mit diesem Medium wurde die anaerobe Fermentation von Glucose zu Lactat in B. megaterium erstmals bestimmt und es wurden erste anaerob Fumarat veratmende Stämme identifiziert. Es konnte eine deutliche Stimulation der Vitamin B12-Biosynthese in B. megaterium durch Anaerobizität, Kobaltzusatz und anaerobe Glycerinfermentation gezeigt werden. Letztere wird jedoch bei gleichzeitiger Fermentation von Glucose auf einem CcpA-unabhängigen Weg wieder unterdrückt. Mit der rekombinanten Produktion von zwei Vitamin B12-Bindeproteinen wurden erste Untersuchungen zur Umgehung einer feed back-Inhibition der Vitamin B12-Biosynthese in B. megaterium durchgeführt. Weiterhin wurde nachgewiesen, dass eine aerobe Fnr-Produktion ähnlich positive Effekte auf die Vitamin B12-Biosynthese ausübt wie Sauerstoffmangel und dass nach der Bildung von Kobalt-Precorrin-3 weitere limitierende Schritte im Biosyntheseweg von Vitamin B12 existieren. Schließlich wurde das gesamte hemAXCDBL-Operon und die erste Teilsequenz des vermutlichen hemEHY-Operons aus B. megaterium kloniert und sequenziert, um eine gezielte Überproduktion von Metaboliten der Vitamin B12-Biosynthese bei paralleler Repression der Hämbiosynthese zu ermöglichen.

Aim of this doctoral thesis was the establishment of a genetically optimised Bacillus megaterium strain for vitamin B12 production. In order to reach this goal a minimal medium was defined, supporting aerobic and anaerobic growth of different vitamin B12 producing B. megaterium strains. With this medium the anaerobic fermentation of glucose to lactate in B. megaterium was firstly demonstrated and the first strains, which anaerobically respire fumarate, were determined. Furthermore a strong stimulation of vitamin B12 biosynthesis in B. megaterium by anaerobic conditions, addition of cobalt and anaerobic fermentation of glycerol was shown, but the latter is suppressed via a CcpA independent pathway when additionally glucose is fermented. With the recombinant production of two vitamin B12 binding proteins the first investigations on avoiding a vitamin B12 biosynthesis feed back inhibition in B. megaterium were performed. Moreover it was shown, that an aerobic Fnr production causes similar positive effects on vitamin B12 biosynthesis as oxygen depletion and that additional limiting steps in vitamin B12 biosynthesis after the formation of cobalt precorrin 3 must exist. Eventually the whole hemAXCDBL-Operon as well as the first part of the presumptive hemEHY-Operon of B. megaterium were cloned and sequenced in order to allow targeted overproduction of vitamin B12 metabolites paralleled by the repression of haem biosynthesis.