Systematische Verfahrensoptimierung im Bereich der Mega-Sequenzierung und ihr exemplarischer Einsatz zur Analyse des Humangenoms

Schön, Oliver

doi:10.24355/dbbs.084-200511080100-558

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Systematische Verfahrensoptimierung im Bereich der Mega-Sequenzierung und ihr exemplarischer Einsatz zur Analyse des Humangenoms

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Im Bereich der Genomsequenzierung führt die technische Entwicklung der Sequenzierautomaten zu einem drastisch steigendem Durchsatz bei der Erzeugung von Rohsequenzen. Um diesen Durchsatz nutzen zu können, muss eine ausreichende Menge an Probenmaterial zur Verfügung gestellt werden. Um dies zu gewährleisten wurde das Herstellungsverfahren von „shotgun“-Banken optimiert. Im Vergleich zum Ausgangsverfahren kann jetzt die 18-fache Menge an „shotgun“-Banken im gleich Zeitraum hergestellt werden. Die bei der „hierachical shotgun“-Strategie verfahrensbedingte Kontamination der „shotgun“- Banken mit Fremd-DNA in Form von genomischer Bakterien-DNA und Klonierungsvektor-DNA wurde deutlich reduziert. Durch optimierte DNA-Präparations- protokolle wurde der durchschnittliche Anteil genomischer Bakterien-DNA von 13,6 auf 3,1 verringert. Zur vollständigen Entfernung von Klonierungs- vektor tragenden Bakterienklonen aus 'shotgun'-Banken wurde, basierend auf Hybridisierungsexperimenten, ein geeignetes Verfahren etabliert. Standardmäßig wird in die Sequenzierreaktion Plasmid-DNA eingesetzt, die zuvor durch Verwendung von Plasmid-DNA-Präparationskits erhalten wurde. Eine kostengünstige Alternative bietet die Template-DNA-Gewinnung durch PCR-Amplifikation. Hierzu wurden Bakterienzellen direkt in den PCR-Ansatz gegeben. Durch Einführung und Optimierung eines Fällungsschritts konnten die PCR-Produkte so weit aufgereinigt werden, das sie problemlos in die Sequenzier- reaktion eingesetzt werden können. Ferner wurden im Rahmen dieser Arbeit zwei Klone des humanen Chromosoms 21 vollständig sequenziert und annotiert. Durch Auswertung dieser Annotations- daten konnten auf einem dieser Klone 2 mögliche Gene gefunden werden.

In the field of genome sequencing the technical development of sequencers leads to a drastically increasing throughput in production of raw sequences. In order to be able to use this throughput, a sufficient quantity of sample material must be made available. In order to ensure this the manufacturing process of 'shotgun'-libraries was optimized. In the comparison to the first used procedure, an 18-fold quantity of 'shotgun'-librarys can be produced now in the same time. The amount of contaminating DNA in form of E.. coli DNA and Cloningvector DNA, which is due to the 'hierachical shotgun'-strategy, was reduced clearly. The average portion of E.coli DNA was reduced from 13,6 to 3,1 by optimizing the DNA preperation process. For complete elemination of Cloningvector carrying bacteria clones from 'shotgun' libraries, a suitable procedure, based on hybridization, was established. Plasmid-DNA for sequencing is normally gained by using Plasmid-DNA preperation kits. An inexpensive alternative is amplification by PCR. For gaining Template-DNA by using PCR, bacteria cells were given directly to the PCR mix. For direct use in sequencing the PCR-product had to be purified. This was achived by introducing a further precipitation step . Furthermore, two clones of human chromosome 21 were completely sequenced and annotated. By analyzing these data 2 putative genes were found on one of these clones.