Untersuchungen zur Struktur und Funktion der Virulenzfaktoren ActA und Internalin B des humanpathogenen Bakteriums Listeria monocytogenes

Machner, Matthias, Peter

doi:10.24355/dbbs.084-200511080100-617

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Untersuchungen zur Struktur und Funktion der Virulenzfaktoren ActA und Internalin B des humanpathogenen Bakteriums Listeria monocytogenes

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In der vorliegenden Arbeit wurde ein Expressionssystem entwickelt, mit dem erstmals große Mengen von ActA gereinigt werden konnten. In Kosedimentations-Experimenten wurde gezeigt, dass ein einzelnes ActA-Molekül gleichzeitig mit bis zu vier Mena EVH1-Domänen interagieren kann. Die Bindungsaffinität der vier FP4-Motive von ActA für die EVH1-Domäne lag dabei im Bereich von 4 µM. Durch gezielte Mutation von ActA wurde nachgewiesen, dass das N-terminale Phenylalanin der FP4-Motive essentiell für die spezifische Interaktion mit der EVH1-Domäne ist, während der Austausch des dritten Prolins ohne signifikante Veränderung der EVH1-Bindung toleriert wurde. In Gleichgewichtssedimentations-Experimenten wurde gezeigt, dass es sich bei ActA um ein monomeres Protein handelt. Die hohe Protease-Sensitivität von ActA sowie der geringe Anteil regulärer Sekundärstrukturelemente weisen auf eine hohe Flexibilität des Moleküls hin. Die Leucin-reiche Wiederholungsregion von InlB enthält fünf oberflächenexponierte aromatische Aminosäuren in nahezu linearer Anordnung. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass Phe104, Trp124, Tyr170 und Tyr214 essentiell für eine Phagozytose InlB321-beschichteter Latexkügelchen sind, wogegen der Austausch von Phe126 keinen erkennbaren Einfluß auf die Invasionseffizienz hatte. Anders als bei InlB321 führte der Austausch einzelner aromatischer Aminosäuren in InlB630 nur zu einer geringen Reduktion der Invasionsaktivität der L. monocytogenes-Zellen. Erst durch Substitution aller fünf aromatischen Aminosäuren in InlB630 wurde die Phagozytose der Bakterien inhibiert. InlB scheint somit hauptsächlich über hydrophobe Wechselwirkung mit dem Wirtszellrezeptor zu interagieren.

An expression system for large scale purification of ActA from L. monocytogenes was established. Using analytical ultracentrifugation studies, it was shown that a single ActA molecule can simultaneously interact with up to four EVH1 domains. Dissociation constants were estimated for each FP4:EVH1 interaction in the range of 4 µM indicating moderate but equivalent affinities. Mutational analysis of individual FP4 motif residues revealed that the N-terminal phenylalanine of the FP4 motif is essential for ActA-EVH1 interaction whereas mutations of the third proline were tolerated. Finally, using sedimentation equilibrium centrifugation techniques, it was shown that ActA is a monomeric protein. The high susceptability of ActA for proteolytic degradation and the low content of regular secondary structure elements suggest a high flexibility of the ActA protein. The leucine-rich repeat domain of InlB contains a string of five surface-exposed aromatic amino acid residues extending along the concave face of the curved domain. the replacement of residues F104, W124, Y170 or Y214 by serine leads to a complete loss of uptake of latex beads coated with InlB', a truncated functional variant of InlB. In contrast to InlB', simultaneous exchange of all aromatic amino acids in full length InlB was required to fully abrogate invasion of entire bacteria. It was concluded that InlB specifically binds to the host cell receptor via hydrophobic interactions.