Struktur- und Funktionsuntersuchungen an der Phosphatidylinositol-spezifischen Phospholipase C (PI-PLC) aus Listeria monocytogenes und der Ena/VASP-Homologie 1 (EVH1)-Domäne des murinen Vesl-2

1. Studien zur Substratbindung der PI-PLC aus L. monocytogenes Um Informationen über die Bindung des Diacylglycerinphosphatanteils von PI durch die PI-PLC aus L. monocytogenes zu erhalten, wurden PI-PLC-Mutanten heterolog in E. coli produziert, gereinigt und zur Kokristallisation mit verschiedenen Substratanaloga eingesetzt. Zusätzlich wurde die Aktivität der Mutanten mit zwei unterschiedlichen Substraten untersucht. Der Austausch einzelner Aminosäuren im aktiven Zentrum der PI-PLC führte zur starken Reduktion der katalytischen Aktivität, wobei die Faltungstopologie der PI-PLC-Mutanten mit der des Wildtyp-Enzyms nahezu identisch war. Mittels Röntgenstrukturanalyse konnten die Substratanaloga jedoch in keiner der aufgeklärten PI-PLC-Strukturen zweifelsfrei nachgewiesen werden. 2. Die EVH1-Domäne von mVesl Die EVH1-Domäne des murinen Vesl-2 (mVesl), einem Mitglied der Homer/Vesl-Proteinfamilie, wurde heterolog in E. coli produziert, gereinigt und zur Kokristallisation mit synthetischen prolinreichen Peptiden eingesetzt, die von den natürlichen Interaktionspartnern abgeleitet worden waren. Die Struktur der mVesl EVH1-Domäne wurde sowohl in freier Form als auch in Komplex mit Teilen eines IP3R-Peptids bei einer Auflösung von 2.2 Å gelöst. Basierend auf diesen strukturellen Daten wurde eine Klassifizierung der bekannten EVH1-Domänen in zwei Gruppen vorgenommen. Die EVH1-Domänen der Ena/VASP-Proteinfamilie wurden der Klasse I zugeordnet, während die Homer/Vesl EVH1-Domänen die Klasse II bilden. Zusätzlich wurde mittels Oberflächen-Plasmonenresonanzspektroskopie gezeigt, dass die verwendeten prolinreichen Peptide mit mäßiger Affinität (KD: 1.5 - 2.9 mM) von mVesl EVH1 gebunden werden.