Expression von Tropoelastin und Lysinoxidase in Pflanzen
Die humanen Proteine Tropoelastin (TEL) und Lysinoxidase (LOX) werden zur in vitro Herstellung des elastischen Polymers Elastin benötigt. Elastin ist das Strukturprotein elastischer Fasern in Vertebraten, das aufgrund seiner elastischen Eigenschaften sowohl für medizinische als auch technische Anwendungen interessant ist. Zur Expression der an der Elastin-Bildung beteiligten Proteine TEL und LOX in Kartoffelpflanzen wurden die humanen Sequenzen an die 'Codon Usage' der Pflanzen angepaßt und die synthetisch hergestellten Gene stabil transformiert. Für die Expression wurden je Protein zwei subzelluläre Kompartimente getestet, die Plastiden und der Apoplast. Die transgenen Linien wurden durch Western-Blot Analyse auf ihren Fremdproteingehalt untersucht. Es konnten zwei Linien identifiziert werden, die plastidär lokalisiertes TEL in einer Menge von ca. 0,05 des löslichen Gesamtproteins enthielten. In den Pflanzenlinien mit sekretiertem TEL lag die Menge des Fremdproteins unterhalb der Nachweisgrenze des Antikörpers. Eine Expression der LOX konnte weder in den Plastiden noch im Apoplasten der transgenen Kartoffelpflanzen beobachtet werden. Parallel zur stabilen Transformation wurden von TEL und LOX GFP-Fusionen hergestellt und transient in Tabakprotoplasten exprimiert. Plastidär lokalisiertes TEL:GFP konnte über Grünfluoreszenz und immunologisch im Sandwich-ELISA nachgewiesen werden. Für LOX zeigte sich, daß das Protein im Pflanzensystem ausschließlich als Vorläuferprotein mit N-terminal fusioniertem Propeptid hergestellt werden kann. Weiterhin wurden beide Proteine in reifer Form in Bakterien- und Hefezellen hergestellt, um die für die Pflanzentests notwendigen Nachweissysteme entwickeln zu können.
The human proteins tropoelastin (TEL) and lysyl oxidase (LOX) are necessary for in vitro production of the elastic polymer elastin. Elastin is the structural protein of elastic fibres in vertebrates. Due to its elastic properties the polymer is an interesting material for medical and technical applications. To express TEL and LOX in potato plants, human cDNA sequences were adapted to the potato codon usage. The synthetic genes were then used for stable transformation. For both proteins, one construct for apoplastic and one for plastidic localization of the protein were cloned. To determine the expression level of the recombinant proteins, the transgenic lines were tested via Western blot analysis. Two lines with detectable amounts of plastidic TEL could be identified. The amount was estimated to be approximately 0,05 of the total soluble protein. Lines transformed with the TEL construct encoding for apoplastic protein localization did not accumulate enough protein for antibody detection. Recombinant LOX could neither be detected in plants transformed with the apoplastic nor with the plastidic construct. Parallel to the stable transformations, constructs for GFP-fusion proteins were made for both proteins and used for transient expression in tobacco protoplasts. Expression of LOX-GFP fusions demonstrated that in plant cells this protein could be expressed as precursor with N-terminal propeptide. Following transient expression of plastidic localized TEL:GFP green fluorescence of the protoplasts could be detected. Moreover, the fusion protein was immunologically detectable by using Sandwich-ELISA. Additionally, TEL and LOX were synthesized in E. coli and the yeast Pichia pastoris to establish the detection systems.
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